一、牦牛血清转铁蛋白的制备及应用——转铁蛋白在无血清细胞培养中的应用（论文文献综述）
王靖舒[1]（2021）在《鸡蛋卵转铁蛋白模拟胃肠消化产物的致敏性》文中指出食物过敏主要通过肠道致敏,食物致敏原蛋白耐胃肠消化或消化后形成含抗原表位的片段是致敏肠道黏膜免疫的重要条件。食物在胃肠道消化时,蛋白质会被逐渐降解,形成大分子片段、小分子肽和氨基酸,在肠道被人体吸收利用。在此过程中,致敏原蛋白会在胃肠消化酶、胃酸等影响下发生结构变化,从而破坏原有的抗原表位或暴露隐藏的抗原表位。当含抗原表位的消化片段经肠道转运后,会引起机体过敏反应。鸡蛋作为致敏率高居第二的常见食物,蛋清中的卵转铁蛋白的致敏性被视为与卵类粘蛋白相似,也具有较强的致敏性。本课题组前期研究也提示,消化后的卵转铁蛋白可能具有较强的潜在致敏性。基于此,本论文继续开展卵转铁蛋白的模拟胃肠消化产物致敏性的评估,期望进一步理解卵转铁蛋白模拟消化产物在食物过敏重要阶段中的作用。本论文以鸡蛋蛋清中卵转铁蛋白为原料,对其分别进行体外模拟婴幼儿和成年人的胃液、小肠液及小肠刷状缘膜酶的消化,评估模拟婴幼儿、成年人消化产物片段与特异性抗体结合的能力;并采用Caco-2细胞单层膜模型测定卵转铁蛋白模拟消化产物在肠上皮细胞的转运能力,研究它们对肠上皮细胞紧密连接蛋白的影响;通过检测小鼠骨髓树突状细胞对卵转铁蛋白模拟消化产物的摄取率,评价其免疫刺激能力;利用BALB/c小鼠构建致敏模型,根据致敏小鼠临床症状、组织病理、血清中特异性抗体、脾细胞中细胞因子分泌、T细胞亚群分化多个生化指标,评估卵转铁蛋白模拟消化产物的致敏性;并结合肠道黏膜免疫系统肠系膜淋巴结中的树突状细胞和不同T细胞亚群的表达,评估卵转铁蛋白模拟消化产物对肠道黏膜免疫系统的影响,进一步阐明卵转铁蛋白经模拟胃肠体外消化产物的致敏机制。主要的研究方法、结果和结论如下:（1）采用弱阳离子交换层析和羟基磷灰石层析结合的方法,提取鸡蛋蛋清中卵转铁蛋白,经SDS-PAGE鉴定,其纯度达到95%以上;将分离纯化体系线性放大并优化,再经一个纯化周期可得到克级卵转铁蛋白,纯度仍高达95%以上。运用Tricine-SDS-PAGE表征卵转铁蛋白分别经体外模拟婴幼儿和成年人体系消化后的产物,发现模拟婴幼儿消化产物中仍有部分未被消化的卵转铁蛋白;而模拟成年人消化产物中则基本不存在未被消化的卵转铁蛋白,且消化产物中较大分子量的片段在数量上也少于模拟婴幼儿消化产物。采用免疫印迹法评估消化产物的潜在致敏性,结果表明模拟婴幼儿和成年人消化的产物中均含有可与特异性抗体Ig G结合的片段,具有一定的潜在致敏性,但模拟婴幼儿消化产物中可结合的片段更多,其潜在致敏性要强于模拟成年人消化产物。（2）实验构建了完整性良好的Caco-2细胞单层膜模型。卵转铁蛋白模拟消化产物都可在Caco-2细胞单层膜上被转运,且同一转运时间段内,转运率为卵转铁蛋白<模拟婴幼儿消化产物<模拟成年人消化产物。对转运后的Caco-2细胞单层膜进行紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的免疫荧光实验,相比模拟成年人消化产物,模拟婴幼儿消化产物对该单层膜细胞间的紧密连接性破坏更严重。此外,实验提取了纯度高达88%的骨髓树突状细胞,将该细胞与荧光标记的卵转铁蛋白模拟消化产物共孵育,采用流式细胞仪检测各类荧光表达。结果显示,卵转铁蛋白被骨髓树突状细胞摄取的比率最低,模拟婴幼儿消化产物的被摄取率高于模拟成年人消化产物;但卵转铁蛋白模拟消化产物激发骨髓树突状细胞产生的表面共刺激分子CD40、CD86无显着影响,仅有模拟婴幼儿消化产物对树突状细胞表面功能因子CD103的表达具有显着上调作用。（3）建立了经口致敏的BALB/c小鼠模型,评估了卵转铁蛋白模拟消化产物的致敏性。从过敏症状、体温变化及空肠、肺部的病变四方面分析表明,卵转铁蛋白组小鼠致敏症状明显,而模拟消化产物组症状均较轻。通过间接ELISA实验测定血清中与Th2相关的特异性抗体水平（Ig E、Ig G和Ig G1）,相比模拟成年人消化产物,模拟婴幼儿消化产物更显着地上调了抗体水平。采用多重因子检测试剂盒检测脾脏细胞分泌的各类细胞因子,模拟婴幼儿消化产物较模拟成年人消化产物更促使脾脏细胞增加Th2型细胞因子的分泌、降低Th1型细胞因子的分泌。将脾脏细胞中T细胞不同亚群进行标记并经流式细胞术检测,结果表明模拟婴幼儿消化产物显着提高了Th2型细胞的表达,降低Th1型细胞的表达,模拟成年人消化产物次之。以上结果说明,卵转铁蛋白模拟消化产物可以促进机体免疫应答向Th2方向偏移,具有一定的致敏性,且致敏性强弱顺序为卵转铁蛋白>模拟婴幼儿消化产物>模拟成年人消化产物。（4）通过小鼠致敏模型,探究卵转铁蛋白模拟消化产物对肠道黏膜免疫系统的影响。采用流式细胞术分析肠系膜淋巴结中多种细胞的表达,结果表明,卵转铁蛋白及其模拟消化产物对小鼠肠道黏膜免疫系统MLN中CD11c+CD103+树突状细胞的表达和CD4+T细胞的表达均无显着影响,仅卵转铁蛋白对CD8+T细胞的表达有显着下调。但卵转铁蛋白及其模拟消化产物均可使MLN中Th1细胞显着下降,Th2细胞表达显着上升,且与空白组相比,模拟成年人消化产物上调MLN中Th2型细胞（P<0.001）、下调Th1型细胞（P<0.001）的程度更小。以上数据说明,卵转铁蛋白显着破坏肠道黏膜免疫系统的平衡,模拟婴幼儿消化产物次之。
刘雨桐[2]（2021）在《C-反应蛋白的血液-组织交换机制研究》文中指出C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）是一种人类急性期因子和炎症标志物,其主要由肝脏合成并运送到血液中参与循环。在动脉粥样硬化斑块、肿瘤等病灶局部组织中也有CRP存在,但病变局部CRP是来自血液循环还是组织分泌,仍然未知。位于血管壁内侧的内皮细胞屏障是介导血液与组织间物质交换的关键界面,分子直径超过3 nm的物质主要需通过穿胞转运来跨越内皮屏障。研究已发现直径为10.5 nm的CRP能够完成这一穿胞转运。我们的实验在培养单层内皮细胞的Transwell模型上验证了CRP的运输具有从血液到组织的定向偏好性。然而在体检测时,我们观察到以不同方式注射到小鼠体内的循环外源CRP并未在组织处积累。随后,当实验引入模拟内皮细胞基底膜（Basement Membrane,BM）的胞外基质时,我们发现它可以调节CRP的血液-组织交换偏好。扫描电镜观察到基质的分子筛结构,CRP在其上的扩散程度受物理厚度影响。全内反射成像还显示从血液侧转运到组织侧的CRP在胞吐后会发生内化,并与胞吐事件间存在时空耦联。由此我们认为,基质调节作用的发挥主要与其多孔网状结构导致的筛分效应相关,当CRP由内皮细胞血液侧转运到组织侧时,即刻被反向转运,避免了循环CRP在局部组织中的过度积累。我们还对其他典型血浆蛋白和多孔基质进行了验证,将基质筛分效应确定为调节血液-组织交换的普适机制。这一机制的发现证明,病灶局部的CRP并非来自循环而是在原位合成,提示了未来应该对局部CRP进行研究。随后,小鼠脏器冰冻切片实验表明局部CRP会导致与疾病风险相关的循环CRP浓度发生微小升高。另外,考虑到病灶局部的CRP会因炎症环境诱导变构为激活态构象（monomeric CRP,mCRP）并暴露出关键序列,我们也通过竞争性结合实验对基于此序列提出的多功能性配体识别模式进行了初步评估。以上研究共同为CRP的生物学功能及其对疾病进程的贡献提供了理论依据。
马斌[3]（2021）在《卵转铁蛋白抗菌肽的制备及纳米粒应用研究》文中进行了进一步梳理卵转铁蛋白（OVT）是含铁的蛋白成员之一,众所周知的就是它表现出的抗菌特性,这种特性主要表现为部分水解OVT衍生的肽,而这种肽的特殊性能有的没有被认知。为了开发OVT抗菌肽,本研究以OVT为酶解原料,抗菌活性为筛选条件,将酶解效果最佳的酶解产物,通过分离纯化技术得到具有抗菌活性的肽段,并对其抗菌机制深入研究。通过肽的作用机制设计了一种高效的靶向细菌细胞的载药纳米系统。然后通过体外实验和体内实验验证了纳米颗粒的抗菌活性,细胞摄取能力,体内靶向治疗能力以及生物安全性。主要研究结果如下:（1）采用两步乙醇提取法从鸡蛋蛋清中获得OVT,随后采用SDS-PAGE对OVT的纯度进行了分析。为获得最佳的具有抗菌活性的水解产物,对胃蛋白酶水解工艺条件进行研究,以抑菌率为指标,通过正交实验获得最佳水解条件。将获得的OVT水解产物首先通过3000 Da的超滤膜,然后采用离子交换色谱,G-15凝胶色谱柱和反相HPLC从OVT水解产物中成功分离出抗菌肽。最后,我们采用LC-MS/MS将其序列鉴定为AGLAPYKLKPIA（“OVTp12”）。OVTp12是一种新颖的十二肽,特别是它带有正电荷且为疏水性,而且空间结构预测和抗菌肽数据库APD的预测结果一致。通过抗菌活性实验,验证了该多肽具有较好的抗菌活性。（2）通过研究OVTp12对不同菌种的抗菌能力发现该多肽对多种菌有抑制效果,尤其是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抗菌活性。OVTp12诱导的外/内细胞膜通透性结果表明,该多肽能够明显改变的大肠杆菌膜的通透性。此外,激光共聚焦和流式细胞实验研究表明,OVTp12能损伤膜的完整度,改变膜的渗透性,进一步揭示其抗菌机理。扫描电镜分析表明,OVTp12可引起大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态学改变。这些结果都表明,卵转铁蛋白多肽OVTp12可能是一种很有前途的食品保鲜或药物抗菌剂。（3）通过抗菌肽OVTp12与细菌细胞膜的相互作用能力,将其修饰在载药的介孔二氧化硅上,从而制备一种具有细菌细胞膜靶向性的新型纳米系统。首先,以共价缩合法制备了MSNs,然后通过交联剂EDC和NHS将多肽通过-COOH基团共价偶联到MSN-NH2上,将MSN或OVTp12@MSN与庆大霉素（Gen）混合,得到MSNs@Gen和MSNs@OVTp12@Gen。采用电镜技术对MSNs、MSNs@Gen和MSNs@OVTp12@Gen进行形貌和微观结构进行了观察,发现其颗粒平均直径逐渐增加,且EDS元素分布分析证明了负载Gen的MSNs被OVTp12成功修饰。此外,XRD,氮气吸附脱附和热重分析也都证明了OVTp12成功修饰在MSNs。在p H 6.5的磷酸缓冲溶液中研究了MSNs@Gen和MSNs@OVTp12@Gen的药物释放行为,发现其在8 h内表现出显着的释放。体外抗菌活性表明多肽修饰后的纳米颗粒展现出更好的抗菌活性,扫描电镜和激光共聚焦的表征也发现MSNs@OVTp12展现出与细菌细胞膜极好的相互作用能力。（4）通过制备OVTp12对大肠杆菌靶向的纳米系统,我们进一步研究其在体内的靶向给药能力。研究表面修饰多肽的纳米颗粒可以改变细胞的摄取能力,为胞内大肠杆菌感染的治疗提供了有希望的选择。值得注意的是,纳米颗粒有效的大肠杆菌靶向能力确保了抗生素在细菌感染部位的聚集,从而达到消除细菌的目的。同时,也将有效地避免滥用抗生素。此外,与游离药物相比,负载抗生素的纳米系统可以避免药物失活,治疗细菌感染,从而减轻体内炎症。同时,该纳米平台展示了高的载药能力和生物相容性好等特点,可应用于多种抗生素的释放,为细菌感染的治疗提供了一种新的思路。
胡婷婷[4]（2020）在《两种心肌损伤标志物的免疫活性浓度准确定量方法研究》文中提出心血管疾病是我国临床上的常见病,极易发展为危重病。心血管疾病的早期诊断需要结合临床症状,心电图,心肌损伤标志物检测等方面进行判断。标志物检测是临床非入侵性诊断的重要方法之一。肌红蛋白和转铁蛋白分别是目前心肌损伤患者早期诊断标志物和急性时相反应标志物,hMYO和hTRF的准确定量有助于心血管疾病病人的早期诊断和病程判断。临床上蛋白质标志物一般采用免疫分析的方法进行定量,因此相比蛋白质的质量浓度或摩尔浓度,其免疫活性浓度成为保障检测结果准确可比的关键,而从源头上建立一种准确的蛋白质免疫活性浓度绝对定量方法成为建立蛋白质免疫活性浓度精准“标尺”的核心。近年来发展起来的基于分子相互作用的无标浓度分析方法（Calibration Free Concentration Analysis,CFCA）能够满足蛋白质免疫活性浓度直接准确定量的目的,该方法基于特定单克隆抗体与蛋白质的相互作用而无需外部标准品即可准确测定能够与抗体结合的抗原浓度。本文通过研究肌红蛋白和转铁蛋白两种心肌标志物的免疫活性浓度准确定量方法,对于保证心肌诊断标志物检测结果准确可比、指导心肌损伤的早期诊断和后续治疗具有重要意义。首先,对人心肌红蛋白纯品的免疫活性浓度定量进行了研究。选择了三种不同的单克隆抗体通过CFCA法对人肌红蛋白进行定量,对抗体的固定化条件、偶联水平、芯片再生条件、最佳范围等进行优化,对方法学参数进行了考察,并与同位素稀释质谱的结果进行了比较。结果表明,在优化条件下采用三种抗体获得的肌红蛋白免疫活性浓度分别为2.985、2.912、3.032 mg/mL,与同位素稀释质谱法（IDMS）获得的人肌红蛋白浓度2.851 mg/mL相当,改变了以前报道中免疫活性浓度显着低于理化分析结果的认识,揭示出通过筛选合适表位的抗体,能够避免蛋白质高级结构及修饰对免疫分析的影响,保持免疫分析与同位素稀释质谱在被测对象上的一致性,从而有助于开发出具有量值准确、良好互换性的标准物质。建立的免疫活性浓度定量方法的日内精密度为2.50%～4.23%,日间精密度为5.85%,表现出了良好的准确度和重复性。通过获得的免疫活性浓度,准确测定了抗体与蛋白质之间的结合参数,得到解离平衡常数分别为8.97×10-9M,1.4×10-10 M,1.55 × 10-10M。实验建立了准确测定与计算免疫活性浓度的流程,探讨了不同抗体与蛋白结合效果差异的原因,研究结果揭示了免疫活性浓度与基于一级氨基酸序列质量浓度或摩尔浓度之间的关系,有助于判断标准物质在不同免疫分析系统上的互换性,从而开发出量值准确、使用范围广的蛋白质标准物质。接着,对复杂基体中心肌标志物的免疫活性浓度测定方法进行了研究。使用两种不同的单克隆抗体通过CFCA法对血清中转铁蛋白进行定量,并与纯品转铁蛋白的结果进行比较。采用MM03和MM06两种抗体测定的人血清转铁蛋白免疫活性浓度分别为1.223 mg/mL,1.064 mg/mL;方法的日内精密度分别为6.44%～7.66%,6.57%～9.07%;日间重复性分别为为7.07%,8.13%。相比之下,MM03抗体表现出较好的重复性与准确度。采用MM03抗体定量纯品转铁蛋白浓度结果为1.282 mg/mL,日内精密度为4.15%～6.86%,日间重复性为6.12%,与质量平衡法和IDMS法结果对比,检测出53.84%的活性蛋白。用该数据将血清中转铁蛋白免疫活性浓度换算到质量浓度,结果为2.271 mg/mL,与生化分析仪检测结果2.464 mg/mL相比误差在10%以内,探索了一条通过免疫活性浓度和IDMS测量换算质量浓度保证不同亲和性抗体免疫检测结果一致的途径。实验建立起复杂基体中蛋白质免疫活性浓度的准确测量方法,其无标记高通量等特点使CFCA有潜力作为一种快速准确定量血清中心肌损伤标志物的方法,对于快速诊断AMI等心血管疾病具有重要意义。
龙丽霞[5]（2020）在《基于磷酰胆碱的载药体系的构建及肿瘤治疗研究》文中研究表明化疗是癌症的主要治疗手段之一,然而传统的化疗存在药物利用率低、毒副作用大等各种问题,利用纳米递送系统改善药物体内分布和肿瘤靶向性能是提高癌症治疗效果的有效途径。磷酰胆碱是一种电中性两性离子基团,具有极强的亲水性,是生物膜中的重要亲水组分。含磷酰胆碱的聚合物具有良好的血液相容性,为开发安全有效的纳米载药系统提供了新的思路。首先,本文构建了以可生物降解的聚乳酸（PLA）为疏水内核、聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（PMPC）为亲水外壳的星形支化PLA-PMPC共聚物纳米胶束,共聚物在PLA核心进行偶联,结构分别为AB3、（AB3）2和（AB3）3。我们系统研究了支化结构对共聚物纳米胶束自组装、胶束表面性能以及胶束在体内性能的影响。研究发现,随着支化程度的增高,共聚物自组装胶束表面磷酰胆碱含量增加,从而提高了自组装纳米胶束的表面亲水性和抗蛋白吸附性能。高支化结构共聚物纳米胶束表现出更长的血液循环时间和更高的肿瘤富集。研究表明（AB3）3型共聚物载药纳米胶束具有良好的肿瘤抑制效果。这项研究为星形支化共聚物纳米胶束在肿瘤治疗的临床应用提供了重要参考依据。其次,本文开发了一种肿瘤微环境响应性长循环单克隆抗体纳米微囊。该纳米微囊以含有磷酰胆碱的MPC为单体,以含有二硫键的二烯丙基二硫醚（DADS）为交联剂,在单克隆抗体表面原位自由基聚合形成。由于PMPC形成的水合层的保护作用,纳米微囊能有效保护单克隆抗体逃避网状内皮系统的捕获,延长了单克隆抗体的体内血液循环时间,改善了单克隆抗体的生物分布。纳米微囊在肿瘤还原环境刺激下响应性释放单克隆抗体,这些单克隆抗体不仅抑制肿瘤细胞增殖,而且可以作用于肿瘤血管内皮细胞,破坏血瘤屏障,进而促进长循环载药纳米微囊在肿瘤组织的进一步积累,致使单次给药就具有良好的肿瘤治疗效果。这种由单克隆抗体的生物学特性和纳米载体的长循环特性协同形成的自增强EPR效应,为基于单克隆抗体的肿瘤治疗提供了可行的策略。最后,本文通过p H响应法成功从血清中分离出Tf R+外泌体,并负载阿霉素用于肿瘤治疗研究。利用转铁蛋白与其受体的特异性结合特性,将表面结合全铁转铁蛋白的超顺磁纳米颗粒与血清共孵育,形成外泌体超顺磁纳米团簇。通过施加磁场将该纳米团簇从血液中提取,并利用转铁蛋白与其受体的酸响应性解离,将超顺磁纳米颗粒从外泌体表面脱离,从而实现血液Tf R+外泌体的精准、高效分离。所获血液Tf R+外泌体可高效介导化疗药物阿霉素的肿瘤靶向治疗,促进了基于外泌体的纳米药物载体的临床转化。
刘锡源[6]（2020）在《功能化纳米材料的生物传感在疾病生物标志物检测中的应用》文中研究说明生物标志物能够客观表征生命体不同生理过程,其检测对于疾病诊断和预防具有非常重要的作用。虽然目前对于生物标记物的检测已经比较成熟和高效,但是在很多情况下其于临床诊断的应用仍然缺乏准确性、敏感性和特异性。在本研究中我们通过构建多种功能化纳米材料的生物传感实现对疾病生物标记物的快速、高通量检测。我们的研究工作主要分为下面三个部分。（1）利用多壁碳纳米管的导电性和易修饰性构建了一种基于ITO的电化学传感器（ITO/Chi/MWCNTs-Tf/BSA）,并将其用于转铁蛋白受体的检测。该方法便捷、快速、成本低,在检测中表现出了高特异性和电化学响应,同时其检测限为0.106 ng/m L,远远低于传统的ELISA方法（75.7 ng/m L）,从而实现对转铁蛋白受体快速、准确的检测。（2）基于金铂纳米粒子修饰e ITO传感器,用于生物标记物电化学检测和荧光增强双重检测。当Au:Pt=1:0时,将其用于100 ng/m L到104 ng/m L不同浓度的Tf R检测时的电化学响应范围为1.02×10-6A～1.98×10-6 A,得到标准曲线为I=-2.41×10-7log[CTf R]+1.99×10-6,相关系数R2=0.9982,展示出了良好的性能;同时,将其应用于荧光增强时,单位面积荧光强度大约为62±2,相比于未修饰的ITO导电玻璃具有明显的增强效果。双平台的设计有助于提升生物标记物检测准确度。（3）将激光捕获显微切割技术（LCM）同基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）结合起来用于宫颈癌单细胞代谢组学的检测。使用PCA和OPLS-DA模型对质谱结果进行统计分析,结果发现两组差异具有显着性（OPLS-DA:Q2=0.647,R2=0.771）,并且其AUC为0.8008。同时,我们基于S-plot图和VIP值筛选出了10个潜在生物标记物。我们为探究宫颈癌发病分子生物学机理和宫颈癌的早期筛查提供了非常重要的技术平台。
石亚珂[7]（2019）在《胎牛空肠隐窝干细胞分离、鉴定及传代培养》文中指出隐窝在小肠上皮细胞更新中起着非常重要的作用,但建立肠隐窝干细胞培养的方法较为困难。目前,已经报道了小鼠肠干细胞分离与培养的方法,仍然没有成功获得其传代细胞系,大动物肠隐窝干细胞分离培养体系也尚未报道。另外由于成体动物肠道微生物复杂,严重影响肠干细胞的分离。所以本研究建立胎牛空肠隐窝干细胞（Fetal bovine jejunal crypt stem cells）原代培养模型,并获得生物学功能稳定的胎牛空肠隐窝干细胞系。本试验选取3-6月龄的胎牛为研究对象,成功建立了一种新的原代肠干细胞培养模型,获得了生物学功能稳定的胎牛空肠隐窝干细胞系,并已经成功传至第40代,为其它动物体外建立分离培养模型及其干细胞系奠定基础。并初步建立了体外3D培养方法,为进一步研究EGF、LPS、VD通过Wnt/β-catenin信号通路对空肠隐窝干细胞模型分裂、增殖、分化的影响奠定基础。主要试验内容及结果如下:1.形态学分析。通过透射电镜、扫描电镜及HE染色,观察了十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠的形态结构,对隐窝细胞进行定位,为后续分离空肠隐窝干细胞奠定了基础;2.分离培养胎牛空肠隐窝干细胞（Fetal bovine jejunal crypt stem cells）及其传代培养。选取3-6月龄胎牛的近端空肠（大约10 cm长）为试验样品。无菌条件下用手术刀片或无菌盖玻片刮擦空肠粘膜以除去上层粘膜和绒毛,再次刮取后用70 μm的细胞筛过滤,取未过滤掉的细胞;添加不同浓度FBS的DMEM培养基对胎牛空肠隐窝干细胞的影响。采用4种FBS浓度:5%、10%、15%、20%的DMEM培养基。当DMEM培养基中添加5%FBS时,培养的胎牛空肠隐窝干细胞增殖能力弱、集落不明显;添加10%FBS时获得增殖能力较强、集落较明显、纯度较高、生物学性状相对稳定的细胞;添加15%FBS时获得增殖能力强、集落明显、纯度高、生物学性状稳定的细胞;添加20%FBS时获得增殖能力强、集落明显、纯度高、生物学性状稳定的细胞,但夹杂许多杂细胞。结果表明,当DMEM培养基中添加的FBS浓度为15%时是胎牛空肠隐窝干细胞培养的最佳浓度;分离培养的胎牛空肠隐窝干细胞以及其传代细胞都具有良好的发育特征,并到目前为止成功将传代细胞传至第40代;3.胎牛空肠隐窝干细胞的鉴定。通过免疫组化技术及转录组测序分析,显示出Lgr5、Bmi1、LRIG1、CD166、MSI1、DCLK1、CD133、CD24在胎牛空肠隐窝干细胞中都有不同程度的表达,故该培养的细胞为空肠隐窝干细胞;4.分离培养成肌纤维细胞（Myofibroblast）及其传代培养。选取3-6月龄胎牛的近端空肠（大约10 cm长）为试验样品。无菌条件下用手术刀片或无菌盖玻片刮擦空肠粘膜以除去上层粘膜和绒毛,再次刮取后将组织剪碎至1 mm3。结果表明,分离培养的胎牛空肠隐窝干细胞以及其传代细胞都具有良好的形态学和生物化学特征并到目前为止成功将传代细胞传至第10代;5.不同添加物对胎牛空肠隐窝干细胞的影响。通过细胞划痕实验及Western Blot技术比较了添加 0、10、50 ng/ml的 EGF,0、10、100、1000 ng/ml 的 LPS 和 0、10、100、1000 nM的VD的DMEM完全培养基对胎牛空肠隐窝干细胞的影响。结果显示,当添加10ng/ml的EGF使受损的胎牛空肠隐窝干细胞恢复速率加快,促进受损后细胞的修复;添加10 ng/ml的LPS可抑制胎牛空肠隐窝干细胞生长;添加10、100、1000 nM的VD均可抑制胎牛空肠隐窝干细胞生长,而添加1000 nM的VD对胎牛空肠隐窝干细胞的生长速率抑制效果更明显;6.体外3D培养。从羊膜中提取基质胶并将其与隐窝悬浮液混合,形成基质胶滴。结果表明,培养7d后空肠类器官形成,生长状态良好。本研究已初步建立了体外3D培养方法。通过对隐窝细胞的定位及检测、体外分离培养及传代培养、免疫组化技术及转录组测序分析,鉴定该培养细胞为胎牛空肠隐窝干细胞,获得了胎牛空肠隐窝干细胞及其传代细胞系;通过细胞划痕实验及Western Blot技术比较了不同添加物对胎牛空肠隐窝干细胞的影响;通过从羊膜中提取基质胶,初步建立了体外3D培养方法。为其它动物体外建立分离培养模型及其干细胞系奠定基础。
张廷斌[8]（2018）在《多功能小分子基因载体的构建及其基因递送行为的研究》文中研究说明基因治疗已被认为是一种有望治愈先天性及恶性疾病的治疗手段。然而,目前递送载体还不能完全满足基因治疗的需求。传统的病毒载体具有较高的基因递送效率,但其潜在的免疫原性和致瘤性限制了其应用。非病毒载体如脂质体、聚阳离子等更加安全,但其体内基因递送效率低。因此,开发安全、高效的基因递送体系仍是基因治疗领域非常关键的问题。本论文,针对基因递送过程中所面临的困难,设计了一系列多功能小分子载体,并对其在体外和体内的基因递送行为进行了系统研究。首先,受病毒核衣壳结构的启发,设计了一种具有自指示功能的类病毒小分子基因载体TR4。该载体能与pDNA组装为具有类似病毒形貌的纳米纤维结构,不仅能高效压缩并保护pDNA不受核酸酶降解,而且在包括肿瘤细胞、正常细胞和胚胎干细胞等多种细胞的转染中都表现出了很高的转染效率。其中,TR4在转染人宫颈癌HeLa细胞时,其转染效率达70%;而作为聚阳离子载体金标准的PEI,其转染效率仅为15%。此外,基于TR4的自指示功能,我们还能够通过激光共聚焦显微镜对载体的基因转染过程进行实时监测,可以为基因载体的优化及筛选提供重要依据。进一步引入转铁蛋白（Tf）,开发了一种兼具主动靶向和自指示功能的类病毒TR4@siRNA@Tf三元复合体系。TR4主要模拟病毒的核衣壳,能够赋予体系自指示以及压缩siRNA的功能;外层的Tf主要模拟病毒的囊膜蛋白,它的引入不仅降低了体系的细胞毒性,而且赋予体系主动靶向的功能。此外,通过利用TR4的自指示功能,我们发现Tf的引入还能加快siRNA在细胞质中的释放。激光共聚焦显微镜结果显示,经过12 h的转染,TR4@Tf主要分布于细胞膜上且仍能很好的共定位;而细胞质内出现了游离的siRNA。主要是因为Tf能够与细胞膜上的转铁蛋白受体相结合,削弱了TR4@Tf与siRNA的结合,从而加快siRNA的释放。因此,我们同时获得了基本结构和转染行为均类似病毒的体系。最后,为实现小鼠肝部ApoB蛋白的沉默,构建了一种具有抗血清能力的氟化寡聚聚乙烯亚胺纳米组装体（fOEI NAs）用于siRNA的递送,并对其抗血清的机制进行了系统性研究。该fOEI材料能够形成形貌类似脂质体的纳米组装体。实验结果表明,fOEI NAs在细胞水平具有高效的基因沉默效率以及优异的抗血清能力,而与其具有相似临界胶束浓度及表面电荷的烷基链修饰的OEI（aOEI-C12NAs）却在血清的存在下基因沉默效率大幅下降。原因是fOEI NAs具有降低血清蛋白吸附的功能,使其在血清存在下仍具有优异的细胞内吞及内涵体逃逸效率。而aOEI-C12 NAs却在血清的存在下,吸附大量蛋白,使其发生聚集并且内涵体逃逸的效率大幅下降。此外,与细胞基因沉默结果一致,fOEI NAs在体内沉默ApoB蛋白的效率也要远高于aOEI-C12 NAs。该研究将为开发血清下高转染效率的载体提供重要参考。
杨立云[9]（2017）在《碳基纳米材料的制备及其生物效应研究》文中研究指明近年来,对碳基纳米材料的研究相当活跃,多种多样的碳纳米材料（如富勒烯及其衍生物、碳点和石墨烯量子点等）层出不穷。碳纳米材料具有非常引人注目的生物活性,如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、化疗增敏、自噬诱导和载药等,因此具有广阔的医学应用前景。据报道,由于亲水性和清除自由基的能力,一些碳纳米材料可用于治疗缺血再灌注损伤、神经变性疾病、电离辐射诱发的损伤以及预防化疗药物介导的毒性。但是,关于这类材料引起生物体毒性的报道也不少见,并且由于生物体系中的研究对象类型繁多,生物效应研究往往侧重于某一层次,很少从不同生命层次上系统地阐明纳米材料生物效应的内在机制,这给研究结果带来一定的局限性。因此,在碳纳米材料应用于生物体系之前,从不同的生命层次系统研究纳米材料的生物效应显得尤为重要。本论文首先制备了水溶性的富勒烯Nano-C60和富勒醇,继而分别从生物大分子（蛋白质）层次、细胞层次和线粒体层次,研究了碳纳米材料（富勒烯、富勒醇和石墨烯量子点）的生物效应。上述研究有助于了解碳纳米材料的生物学行为,对碳纳米材料在生物医学领域的安全应用,具有很重要的意义。本论文共分为六章:第一章:对碳材料（富勒烯、富勒醇和石墨烯量子点）的基本性质、生物应用以及在生物大分子、细胞和线粒体层次的生物效应的研究进展做了较为全面的介绍。第二章:首先采用溶剂交换法,制备水溶性的富勒烯纳米颗粒（Nano-C60）,并运用紫外-可见吸收光谱、MALDI-TOF质谱、透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对制备的Nano-C60进行了表征。之后,综合采用多种光谱手段和等温滴定微量热技术（ITC）研究了 Nano-C60与人转铁蛋白（Tf）的相互作用。荧光猝灭的结果表明:Nano-C60与Tf结合,形成静态复合物;两者之间的相互作用以静电作用力为主。同步荧光光谱和圆二色谱（CD）的结果显示Nano-C60对Tf的二级结构产生影响。ITC的结果表明Nano-C60与Tf的结合是自发过程,主要由焓驱动。第三章:采用化学合成的方法,将羟基引入富勒烯表面,制备水溶性富勒烯羟基衍生物（富勒醇,C60（OH）44）,并通过红外光谱（IR）、热重分析（TGA）和元素分析确定了制备的富勒醇的结构,使用DLS测量富勒醇在水溶液中的粒径分布。然后,用多种光谱法如荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和CD,系统研究了富勒醇与两种血清蛋白BSA和y-globulins的相互作用。结果显示,富勒醇猝灭两种血清蛋白的内源荧光是由动态猝灭所引起的。富勒醇与蛋白相互作用的解离常数在同一数量级。此外,富勒醇对两种蛋白的构象没有明显影响。用等温滴定微量热技术考察富勒醇与BSA和γ-globulins相互作用的热力学性质,结果显示:富勒醇与BSA相互作用为放热过程,而与γ-globulins的相互作用为吸热过程。但两个过程均得到负的吉布斯自由能,表明富勒醇与两种蛋白的相互作用在热力学上是有利的。第四章:采用MTT、流式细胞术、激光共聚焦显微成像、透射电子显微成像和凝胶电泳等方法和技术,研究了富勒醇对胃癌细胞SGC-7901的细胞活性、自噬以及溶酶体功能的影响。结果表明:在正常培养条件下,富勒醇几乎不影响细胞SGC-7901的活性。当剥夺血清之后,富勒醇对细胞活性的抑制作用呈现明显的剂量和时间依赖性。同时观察到细胞质中出现大量的空泡,并检测到ROS的大量积累。富勒醇可以造成细胞内自噬体的积累,在MDC染色的细胞中观察到了酸性细胞器的增多,检测到自噬相关蛋白LC3水平的升高,并在TEM图中观测到自噬性结构。富勒醇作用细胞会造成细胞内p62的积累,这预示着自噬流可能受到了抑制。并且富勒醇影响溶酶体功能,造成溶酶体膜通透、内环境碱化和主要水解酶活性的降低。这说明富勒醇可能通过损伤溶酶体抑制自噬,从而造成自噬体的积累。在饥饿条件下,基础自噬被抑制可能是造成细胞死亡的主要原因。而饥饿条件下富勒醇诱导的细胞死亡可以被自噬抑制剂3-MA缓解。因此富勒醇在饥饿条件下对肿瘤细胞的杀伤能力,可能为胃癌治疗提供一个新的策略。第五章:采用紫外-吸收光谱、荧光光谱、流式细胞术、液相溶氧测试系统以及TEM等多种手段,全面考察了富勒醇对大鼠肝脏离体线粒体结构和功能的影响。结果表明:富勒醇能诱导线粒体MPT,引起线粒体的基质肿胀,降低线粒体的膜电势以及增强线粒体内膜对H+、K+的通透性。富勒醇可以作用于线粒体内膜的极性蛋白区域,并对线粒体膜流动性产生影响。通过检测呼吸速率的改变,发现富勒醇不仅影响线粒体内膜的完整性,也会损伤线粒体的呼吸链。本章的实验结果,为全面认识富勒醇在亚细胞层次的毒性机理,提供了一个参考。第六章:采用MTT、激光共聚焦显微成像、凝胶电泳和TEM等方法和手段,初步探讨了石墨烯量子点（GQDs）对人胃癌细胞SGC-7901的作用。结果表明:GQDs可以进入细胞,呈现出明亮的黄色荧光,而且对细胞几乎没有毒性。检测到自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平的升高,并在TEM的图中观察到自噬特征性结构。之后的p62降解和LC3 turn over的结果表明了自噬的激活。除此之外,GQDs还可以有效减缓H202诱导的细胞毒性。
秦晓蓉[10]（2012）在《金属蛋白制备及性质研究》文中研究表明金属蛋白—含有金属的蛋白—生命过程都离不开金属蛋白，人体内的蛋白大约1/3是金属蛋白，它对生命活动的基本过程很重要，包括DNA合成、新陈代谢、消除毒素以及生命所需的碳、氧和氮的化学转化。许多疾病是由于金属失衡或关键金属酶失活引起的，金属蛋白的制备和性能研究是理解其生理功能的前提。针对转铁蛋白提取，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD, EC1.15.1.1）的提取及性能和超氧化物歧化酶模拟酶的合成进行了研究，转铁蛋白是铁结合的血清糖蛋白，调控体液中游离铁水平，超氧化物歧化酶能将有害的超氧阴离子自由基歧化为无害的分子氧和双氧水。转铁蛋白和超氧化物歧化酶与越来越多的疾病相关联，包括炎症、癌症和糖尿病，因此它们在医药、营养和化妆行业有重要作用。转铁蛋白和超氧化物歧化酶从粗品通过两步纯化可获取纯品，第一步，热激法、硫酸铵沉淀法用于粗酶液的初步纯化。进一步纯化包括凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析。得到的主要结论如下：（1）鸭血清转铁蛋白经过两步纯化，热激和固定化金属螯合亲和层析，能获得光谱纯的鸭血清转铁蛋白。（2）南瓜瓤是制备超氧化物歧化酶的新的、廉价的和可再生的资源。测试药食两用蔬菜中超氧化物歧化酶的活性，发现有些蔬菜，如南瓜瓤、南瓜果肉、南瓜籽和大蒜SOD每克样品（干基）超氧化物歧化酶酶活都高于500IU，属于富含超氧化物歧化酶的药食两用植物。其中南瓜瓤和南瓜果肉都高于南瓜籽；南瓜瓤和南瓜果肉都高于大蒜；而南瓜瓤中超氧化物歧化酶酶活最高。南瓜瓤是生产南瓜粉、南瓜籽和南瓜籽油等的副产品，是提取超氧化物歧化酶的廉价资源。（3）建立了从南瓜瓤提取超氧化物歧化酶的简单而有成本效益的纯化方法。南瓜瓤用磷酸缓冲液浸提，经热激与硫酸铵沉淀耦合和亲和层析，能获得电泳纯的超氧化物歧化酶纯品，纯化倍数达到87，酶活收率为42%，比活为2884IU·mg-1蛋白。（4）南瓜瓤超氧化物歧化酶是首次发现源于植物的糖基化SOD。南瓜瓤超氧化物歧化酶是同型二聚体，由两条相同的亚基组成，用MicrOTOF-Q质谱仪测得亚基分子量为17477Da，用凝胶过滤层析测得超氧化物歧化酶分子量为35.0kDa。南瓜瓤超氧化物歧化酶是Cu,Zn-SOD，每条亚基含有约1个铜和1个锌，并且对H2O2敏感。南瓜瓤Cu,Zn-SOD是糖蛋白，其分子量较其他植物Cu,Zn-SOD的高，pH稳定性范围较其他植物Cu,Zn-SOD的宽。在25℃，2h，南瓜瓤Cu,Zn-SOD在pH4～12保持其活性，在pH7.8，45min，南瓜瓤Cu,Zn-SOD在低于50℃保持其活性。南瓜瓤Cu,Zn-SOD活性被SDS和NaN3轻微抑制，而Na3BO3和柠檬酸钠对其活性没有影响。由此，被当作废弃物的南瓜瓤，是提取Cu,Zn-SOD的优质原料，可被化妆、医药和营养行业商业开发。（5）合成了槲皮素铜及槲皮素锌配合物，然而，由于其低活性，它们不能作为超氧化物歧化酶模拟化合物，也许可以作为电荷调节剂。鸭血清转铁蛋白和南瓜瓤Cu,Zn-SOD被成功纯化，它们是金属结合的糖蛋白。
二、牦牛血清转铁蛋白的制备及应用——转铁蛋白在无血清细胞培养中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牦牛血清转铁蛋白的制备及应用——转铁蛋白在无血清细胞培养中的应用（论文提纲范文）
（1）鸡蛋卵转铁蛋白模拟胃肠消化产物的致敏性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 鸡蛋过敏 |
| 1.1.1 鸡蛋过敏的流行病学 |
| 1.1.2 鸡蛋过敏的免疫机制 |
| 1.1.3 鸡蛋主要致敏原 |
| 1.1.4 鸡蛋过敏的危害及研究现状 |
| 1.2 食物致敏原致敏性评价方法 |
| 1.2.1 食物致敏原致敏性体外评价方法 |
| 1.2.2 食物致敏原胃肠消化与致敏性 |
| 1.2.3 食物致敏原致敏性的动物学实验评价 |
| 1.3 食物过敏关联的肠道免疫细胞 |
| 1.3.1 树突状细胞 |
| 1.3.2 Th1 与Th2 细胞 |
| 1.3.3 Th17 细胞 |
| 1.3.4 Tregs细胞 |
| 1.4 立题背景和研究内容 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 立题背景 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 第2章 卵转铁蛋白体外模拟消化产物与特异性抗体的结合 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 卵转铁蛋白的小体系分离纯化、鉴定 |
| 2.3.2 卵转铁蛋白的克级提取及除盐、浓缩 |
| 2.3.3 卵转铁蛋白的浓度鉴定 |
| 2.3.4 卵转铁蛋白的体外模拟婴幼儿胃液、小肠液、BBM酶消化 |
| 2.3.5 卵转铁蛋白的体外模拟成年人胃液、小肠液、BBM酶消化 |
| 2.3.6 卵转铁蛋白消化产物的Tricine-SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.7 卵转铁蛋白与特异性抗体IgG结合的能力 |
| 2.3.8 数据统计与分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 卵转铁蛋白的分离纯化及鉴定 |
| 2.4.2 卵转铁蛋白的浓度 |
| 2.4.3 卵转铁蛋白在模拟婴幼儿消化液中的消化 |
| 2.4.4 卵转铁蛋白在模拟成年人消化液中的消化 |
| 2.4.5 卵转铁蛋白模拟消化产物与IgG特异性结合的能力 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 卵转铁蛋白的分离纯化方法的选择及放大化制备 |
| 2.5.2 婴幼儿及成年人胃肠系统的生理特点及体外模拟消化体系的建立 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 卵转铁蛋白模拟消化产物对Caco-2 细胞屏障的影响及被树突状细胞摄取的性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Caco-2 细胞的培养 |
| 3.3.2 Caco-2 细胞单层膜模型的建立 |
| 3.3.3 卵转铁蛋白模拟消化产物对Caco-2 单层膜的增殖毒性及跨膜转运 |
| 3.3.4 卵转铁蛋白模拟消化产物对Caco-2 单层膜紧密连接蛋白分布的影响 |
| 3.3.5 小鼠骨髓树突状细胞的提取及培养 |
| 3.3.6 树突状细胞对卵转铁蛋白模拟消化产物的摄取 |
| 3.3.7 卵转铁蛋白模拟消化产物对树突状细胞表面功能因子表达的影响 |
| 3.3.8 数据统计与分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 Caco-2 细胞的生长形态 |
| 3.4.2 Caco-2 细胞单层膜模型的完整性评价 |
| 3.4.3 卵转铁蛋白模拟消化产物对Caco-2 单层膜的增殖毒性及跨膜转运 |
| 3.4.4 卵转铁蛋白模拟消化产物对Caco-2 单层膜紧密连接蛋白分布的影响 |
| 3.4.5 骨髓树突状细胞的纯度 |
| 3.4.6 不同时间段中树突状细胞对卵转铁蛋白模拟消化产物的摄取 |
| 3.4.7 卵转铁蛋白模拟消化产物对树突状细胞表面功能因子表达的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 Caco-2 细胞模型的应用 |
| 3.5.2 卵转铁蛋白消化产物对Caco-2 细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 3.5.3 树突状细胞对卵转铁蛋白模拟消化产物的摄取 |
| 3.5.4 卵转铁蛋白模拟消化产物对树突状细胞表面功能因子表达的影响 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 卵转铁蛋白体外模拟消化产物的致敏性动物实验 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 BALB/c小鼠过敏模型的建立 |
| 4.3.2 小鼠致敏期间血清效价变化及激发后症状、体温的变化 |
| 4.3.3 小鼠空肠及肺部组织变化 |
| 4.3.4 小鼠外周血单核细胞的增殖毒性实验 |
| 4.3.5 小鼠血清中特异性抗体(Ig E、Ig G、Ig G1)的检测 |
| 4.3.6 小鼠血清中肥大细胞蛋白酶的检测 |
| 4.3.7 小鼠脾细胞中细胞因子的检测 |
| 4.3.8 小鼠脾细胞中Th1 与Th2 细胞的鉴定 |
| 4.3.9 数据统计与分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 BALB/c致敏小鼠致敏期间血清效价变化 |
| 4.4.2 小鼠激发后临床症状评分、体温变化 |
| 4.4.3 小鼠空肠及肺部组织的病理变化 |
| 4.4.4 小鼠外周血单核细胞的增殖毒性 |
| 4.4.5 小鼠血清特异性抗体的水平 |
| 4.4.6 小鼠血清中肥大细胞蛋白酶的变化 |
| 4.4.7 小鼠脾细胞中细胞因子的变化 |
| 4.4.8 小鼠脾细胞中Th1 与Th2 细胞的鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 小鼠致敏模型的建立 |
| 4.5.2 小鼠体液免疫与血清中特异性抗体水平的分析 |
| 4.5.3 小鼠细胞免疫与细胞因子的平衡 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 卵转铁蛋白体外模拟消化产物对肠道黏膜免疫细胞的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 小鼠MLN细胞悬液的制备 |
| 5.3.2 小鼠MLN中树突状细胞的鉴定 |
| 5.3.3 小鼠MLN中 CD4+T 细胞与CD8+T 细胞的鉴定 |
| 5.3.4 小鼠MLN中 Th1与Th2 细胞的鉴定 |
| 5.3.5 小鼠MLN中 Tregs细胞的鉴定 |
| 5.3.6 数据统计与分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 小鼠MLN中树突状细胞的表达 |
| 5.4.2 小鼠MLN中 CD4+T 细胞和CD8+T 细胞的鉴定 |
| 5.4.3 小鼠MLN中 Th1与Th2 细胞的鉴定 |
| 5.4.4 小鼠MLN中 Tregs细胞的鉴定 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 肠道黏膜免疫细胞中CD103+树突状细胞的表达 |
| 5.5.2 小鼠肠道黏膜免疫细胞中T细胞的调控作用 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（2）C-反应蛋白的血液-组织交换机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 血管内皮细胞及胞外基质 |
| 1.1.1 血管内皮细胞特征 |
| 1.1.2 血管内皮细胞蛋白运输途径 |
| 1.1.3 细胞外基质特征及影响 |
| 1.2 急性期血浆蛋白CRP |
| 1.2.1 CRP结构 |
| 1.2.2 CRP功能 |
| 1.3 其他可穿胞转运的典型血液蛋白 |
| 1.3.1 低密度脂蛋白简介 |
| 1.3.2 转铁蛋白简介 |
| 1.4 CRP的局部功能态形式mCRP |
| 1.4.1 mCRP结构功能 |
| 1.4.2 mCRP发挥作用的结构域aa35-47 |
| 1.5 本研究的选题依据与创新性意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验蛋白 |
| 2.1.2 实验细胞及动物 |
| 2.1.3 主要仪器及耗材 |
| 2.1.4 实验主要试剂 |
| 2.2 荧光标记蛋白制备及细胞培养 |
| 2.2.1 标记蛋白制备及浓度测定 |
| 2.2.2 内皮细胞的一般培养操作 |
| 2.2.3 建立“基质+内皮细胞”Transwell转运模型 |
| 2.3 酶联免疫吸附相关实验 |
| 2.3.1 酶联免疫吸附主要实验方法 |
| 2.3.2 检测Tranwell模型上的蛋白转运量 |
| 2.3.3 检测不同CRAC与配体的竞争性结合 |
| 2.4 全内反射显微镜观察活细胞成像 |
| 2.5 荧光成像相关实验 |
| 2.5.1 常用荧光共聚焦方法 |
| 2.5.2 检测标记蛋白在实验体系的分布 |
| 2.6 动物相关实验 |
| 2.6.1 小鼠静脉注射及CRP代谢检测 |
| 2.6.2 小鼠脏器冰冻切片实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 未引入基质时CRP在体、离体穿胞转运存在差异 |
| 3.1.1 CRP离体穿胞转运具有血液到组织侧的定向偏好 |
| 3.1.2 CRP的在体穿胞转运无从顶生至侧底生方向的偏好性 |
| 3.2 加入基质可以调节CRP穿胞转运的方向偏好性 |
| 3.2.1 建立引入BM的 Transwell模型 |
| 3.2.2 BM调节CRP穿胞转运的定向偏好 |
| 3.2.3 BM调节LDL和 Transferrin穿胞转运的定向偏好 |
| 3.3 基膜因为筛分效应影响CRP的穿胞转运方向 |
| 3.3.1 BM具有成为分子筛的基础结构 |
| 3.3.2 CRP、Tf穿胞转运后在BM中的分布情况 |
| 3.3.3 转运至侧底生侧CRP胞吐和胞吐事件间存在时空偶联 |
| 3.3.4 琼脂糖凝胶也能改变CRP穿胞转运方向偏好性 |
| 3.3.5 利用不同器官中血管BM完整性差异在体检验筛分效应 |
| 3.4 局部CRP对血液CRP水平存在影响 |
| 3.5 局部CRP激活态构象的功能结合基序 |
| 3.5.1 不同物种CRAC竞争性抑制mCRP与配体的结合 |
| 3.5.2 不同蛋白CRAC竞争性抑制mCRP与配体的结合 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 主要结果讨论 |
| 4.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）卵转铁蛋白抗菌肽的制备及纳米粒应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵转铁蛋白及其多肽研究现状 |
| 1.1 卵转铁蛋白简介 |
| 1.2 卵转铁蛋白酶解工艺 |
| 1.3 卵转铁蛋白多肽的制备 |
| 1.4 卵转铁蛋白多肽的生物学活性 |
| 1.5 卵转铁蛋白多肽的应用前景 |
| 2 纳米载药系统研究现状 |
| 2.1 纳米颗粒治疗细菌感染简介 |
| 2.2 靶向细菌纳米载体 |
| 2.3 环境响应性纳米载体 |
| 2.4 纳米载体递送组合药物 |
| 3 常用纳米载体材料 |
| 3.1 无机纳米载体二氧化硅 |
| 3.2 聚合物纳米载体PLGA |
| 3.3 树状大分子纳米载体 |
| 3.4 脂质体纳米载体 |
| 4 研究目的与主要内容 |
| 4.1 研究目的与意义 |
| 4.2 研究主要内容 |
| 4.3 技术路线 |
| 第二章 卵转铁蛋白抗菌肽的酶法制备及分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 纯化和鉴定OVT |
| 2.2 卵铁蛋白酶解工艺 |
| 2.3 正交实验 |
| 2.4 肽的分离纯化 |
| 2.5 肽的鉴定 |
| 2.6 肽的空间结构 |
| 2.7 抗菌活性的验证 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 卵转铁蛋白抗菌肽OVTp12 的抑菌机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 最小抑菌浓度 |
| 2.2 时间杀菌曲线 |
| 2.3 外膜渗透性的测定 |
| 2.4 内膜渗透性的测定 |
| 2.5 膜完整性分析 |
| 2.6 激光共聚焦分析 |
| 2.7 扫描电镜分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 抗菌肽OVTp12 修饰负载药物的介孔二氧化硅递送系统的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MSNs@OVTp12@Gen的制备 |
| 2.2 纳米粒的电镜表征 |
| 2.3 纳米粒的粒径及Zeta电位分析 |
| 2.4 纳米粒的氮气吸附-脱附测定 |
| 2.5 纳米粒的X射线衍射(XRD)分析 |
| 2.6 纳米粒的TGA分析 |
| 2.7 纳米粒的体外释放测定 |
| 2.8 纳米粒的抗菌活性 |
| 2.9 纳米粒与细菌细胞的相互作用 |
| 2.10 活/死细胞分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 靶向细菌纳米粒杀灭大肠杆菌及其相关感染的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 纳米粒细胞毒性分析 |
| 2.2 纳米颗粒的细胞摄取分析 |
| 2.3 透射电镜分析 |
| 2.4 体内细菌感染靶向治疗效果及毒性评价 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 研究生期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）两种心肌损伤标志物的免疫活性浓度准确定量方法研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心肌损伤标志物 |
| 1.1.1 心肌损伤标志物及其应用 |
| 1.1.2 肌红蛋白及其检测方法 |
| 1.1.3 人转铁蛋白及其检测方法 |
| 1.2 蛋白定量方法的现状 |
| 1.2.1 非免疫学分析方法 |
| 1.2.1.1 液相色谱法 |
| 1.2.1.2 液相色谱质谱法(LC-MS) |
| 1.2.1.3 同位素稀释质谱法(IDMS) |
| 1.2.1.4 毛细管电泳法 |
| 1.2.2 免疫学方法 |
| 1.2.2.1 酶联免疫检测法(ELISA) |
| 1.2.2.2 免疫荧光法 |
| 1.2.2.3 免疫胶体金法 |
| 1.2.2.4 Western blot法 |
| 1.3 表面等离子体共振技术(SPR) |
| 1.3.1 表面等离子体共振技术光学原理 |
| 1.3.2 表面等离子体共振技术定量原理 |
| 1.3.2.1 无标定量法 |
| 1.3.3 表面等离子体共振技术的应用 |
| 1.3.3.1 表面等离子共振技术在生物医学领域的应用 |
| 1.3.3.2 表面等离子共振技术在食品检测领域的应用 |
| 1.3.3.3 表面等离子共振技术在环境化工领域的应用 |
| 1.3.3.4 表面等离子共振技术与其他技术的联用 |
| 1.4 课题提出 |
| 第二章 基于SPR的人心肌红蛋白免疫活性浓度绝对测定方法研究 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 纯度测定 |
| 2.2.2 圆二色谱鉴定蛋白质二级结构 |
| 2.2.3 蛋白质鉴定 |
| 2.2.4 肌红蛋白分子量测定及扩散系数计算 |
| 2.2.5 肌红蛋白总蛋白定量 |
| 2.2.6 无标定量法测定肌红蛋白含量 |
| 2.2.6.1 定量原理 |
| 2.2.6.2 抗体偶联 |
| 2.2.6.3 芯片再生溶液筛选 |
| 2.2.6.4 肌红蛋白样品的制备 |
| 2.2.6.5 肌红蛋白的无标定量分析 |
| 2.2.6.6 动力学研究 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 凝胶排阻色谱纯度结果 |
| 2.3.2 圆二色谱检测二级结构 |
| 2.3.3 蛋白质鉴定结果 |
| 2.3.4 MALDI-TOF分子量测定结果及扩散系数 |
| 2.3.5 肌红蛋白IDMS测定结果 |
| 2.3.6 无标定量法测定肌红蛋白含量 |
| 2.3.6.1 抗体稀释液pH筛选结果 |
| 2.3.6.2 芯片再生溶液筛选结果 |
| 2.3.6.3 CFCA预试验 |
| 2.3.6.3 抗体偶联水平优化 |
| 2.3.6.4 CFCA法测定结果 |
| 2.3.6.5 重复性和再现性 |
| 2.3.6.6 动力学考察 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 基于SPR的人血清中转铁蛋白免疫活性浓度绝对测定方法研究 |
| 3.1 试剂与仪器 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 转铁蛋白分子量测定及扩散系数计算 |
| 3.2.2 抗体偶联pH筛选 |
| 3.2.3 抗体偶联浓度及芯片偶联 |
| 3.2.4 再生溶液筛选 |
| 3.2.5 人血清中转铁蛋白样品的制备 |
| 3.2.6 人血清中转铁蛋白样品的无标定量分析 |
| 3.2.7 纯品转铁蛋白样品的无标定量分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 MALDI-TOF分子量测定结果及扩散系数 |
| 3.3.2 人血清中转铁蛋白生化分析仪测定结果 |
| 3.3.3 抗体稀释液pH筛选结果 |
| 3.3.4 抗体稀释浓度筛选结果及芯片偶联 |
| 3.3.5 芯片再生溶液筛选结果 |
| 3.3.6 人血清中转铁蛋白定量预试验 |
| 3.3.7 人血清中转铁蛋白样品的无标定量分析 |
| 3.3.8 纯品转铁蛋白样品的无标定量分析 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（5）基于磷酰胆碱的载药体系的构建及肿瘤治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 纳米载药系统 |
| 1.1.1 肿瘤的临床治疗现状 |
| 1.1.2 纳米载药系统用于肿瘤靶向治疗 |
| 1.1.3 纳米载体特性影响体内行为 |
| 1.2 磷酰胆碱 |
| 1.2.1 磷酰胆碱基聚合物材料的生物相容性 |
| 1.2.2 磷酰胆碱基聚合物在生物医药领域的应用 |
| 1.3 支化聚合物作为纳米载体 |
| 1.3.1 星形聚合物 |
| 1.3.2 超支化和树枝状聚合物 |
| 1.3.3 接枝、刷状和梳状聚合物 |
| 1.3.4 聚合物交联网络 |
| 1.4 外泌体应用于药物投递 |
| 1.4.1 外泌体的生物学特性 |
| 1.4.2 外泌体的分离方法 |
| 1.4.3 外泌体在药物递送领域的应用 |
| 1.5 肿瘤微环境响应型纳米载药体系 |
| 1.5.1 弱酸响应 |
| 1.5.2 酶响应 |
| 1.5.3 还原响应 |
| 1.5.4 乏氧响应 |
| 1.6 选题依据与研究目的 |
| 第二章 含磷酰胆碱星形支化共聚物纳米胶束体内长循环及肿瘤靶向性能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.3 sCPM的制备 |
| 2.2.4 sCPM的表征 |
| 2.2.5 sCPM的蛋白吸附测定 |
| 2.2.6 sCPM的细胞毒性 |
| 2.2.7 sCPM的肿瘤细胞摄取 |
| 2.2.8 sCPM的载药及药物释放 |
| 2.2.9 sCPM体内循环时间的测定 |
| 2.2.10 sCPM的体内分布及肿瘤靶向 |
| 2.2.11 D-sCPM的肿瘤治疗效果 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 sCPM的表征 |
| 2.3.2 sCPM的稳定性 |
| 2.3.3 sCPM的抗蛋白吸附性能 |
| 2.3.4 sCPM的细胞毒性 |
| 2.3.5 sCPM的肿瘤细胞摄取 |
| 2.3.6 sCPM的载药及其药物释放 |
| 2.3.7 sCPM的体内血液循环时间 |
| 2.3.8 sCPM的体内分布及肿瘤靶向 |
| 2.3.9 D-sCPM的肿瘤抑制效果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 肿瘤微环境响应性单抗纳米载体的构建及其抗肿瘤研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.3 西妥昔单抗纳米微囊的制备 |
| 3.2.4 西妥昔单抗纳米微囊的表征 |
| 3.2.5 西妥昔单抗纳米微囊的降解释放 |
| 3.2.6 西妥昔单抗纳米微囊体外肿瘤细胞抑制 |
| 3.2.7 巨噬细胞对西妥昔单抗纳米微囊的摄取 |
| 3.2.8 西妥昔单抗纳米微囊的血液循环时间 |
| 3.2.9 西妥昔单抗纳米微囊的体内分布 |
| 3.2.10 西妥昔单抗纳米微囊的脏器毒性 |
| 3.2.11 透射电镜观察肿瘤血管形态 |
| 3.2.12 西妥昔单抗纳米微囊体内抑制肿瘤研究 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 西妥昔单抗纳米微囊的制备及表征 |
| 3.3.2 西妥昔单抗纳米微囊的降解释放 |
| 3.3.3 西妥昔单抗纳米微囊体外肿瘤细胞抑制 |
| 3.3.4 西妥昔单抗体纳米微囊的巨噬细胞摄取性能 |
| 3.3.5 西妥昔单抗体纳米微囊的体内循环时间 |
| 3.3.6 西妥昔单抗纳米微囊的体内分布 |
| 3.3.7 西妥昔单抗纳米微囊的体内毒性 |
| 3.3.8 西妥昔单抗纳米微囊的自增强EPR效应 |
| 3.3.9 西妥昔单抗纳米微囊的肿瘤治疗效果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 pH响应法分离TfR+外泌体及其肿瘤靶向药物投递研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.3 全铁转铁蛋白修饰SPMNs |
| 4.2.4 SMNC-EXOs的制备 |
| 4.2.5 M-EXOs的制备 |
| 4.2.6 M-EXOs的表征 |
| 4.2.7 M-EXOs的细胞毒性 |
| 4.2.8 M-EXOs的血液相容性 |
| 4.2.9 M-EXOs的肿瘤细胞摄取 |
| 4.2.10 M-EXOs的载药和药物释放 |
| 4.2.11 D-M-EXOs的肿瘤细胞抑制作用 |
| 4.2.12 D-M-EXOs的体内分布及其肿瘤靶向 |
| 4.2.13 D-M-EXOs的体内肿瘤抑制效果 |
| 4.2.14 D-M-EXOs的脏器毒性 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 M-EXOs的制备及表征 |
| 4.3.2 pH响应性分离机制 |
| 4.3.3 M-EXOs的生物安全性评价 |
| 4.3.4 M-EXOs的肿瘤细胞摄取 |
| 4.3.5 M-EXOs的载药及药物释放 |
| 4.3.6 D-M-EXOs的肿瘤细胞抑制效果 |
| 4.3.7 D-M-EXOs的体内分布及肿瘤靶向 |
| 4.3.8 D-M-EXOs的体内抑制肿瘤效果 |
| 4.3.9 D-M-EXOs的脏器毒性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩略语/符号说明 |
| 发表论文和科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）功能化纳米材料的生物传感在疾病生物标志物检测中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物标记物 |
| 1.1.1 细胞表面受体 |
| 1.1.2 代谢物 |
| 1.2 电化学生物传感器 |
| 1.2.1 电化学工作站介绍 |
| 1.2.2 电化学生物传感器介绍 |
| 1.2.3 ITO导电玻璃在电化学生物传感器中的研究进展 |
| 1.2.4 纳米材料用于电化学信号增强 |
| 1.2.5 基于配体-受体结合的电化学传感器研究进展 |
| 1.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 |
| 1.4 论文的主要内容与章节安排 |
| 第二章 纳米材料修饰ITO导电玻璃用于转铁蛋白受体检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 转铁蛋白受体 |
| 2.1.2 转铁蛋白受体的检测方法 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂与材料 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 ITO导电玻璃工作区域的控制 |
| 2.3.2 修饰ITO电化学传感器的表征 |
| 2.3.3 修饰ITO电化学传感器的优化 |
| 2.3.4 修饰ITO电化学传感器用于转铁蛋白受体的检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 AU/PTNPS修饰EITO传感器用于生物标记物的双重检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 金铂纳米粒子用于电化学传感器的研究进展 |
| 3.1.2 金属表面荧光增强 |
| 3.1.3 玻璃表面贵金属纳米粒子的修饰方法研究进展 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂与材料 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.2.3 金铂纳米粒子电沉积的ITO传感器的制备 |
| 3.2.4 eITO传感器的表征 |
| 3.2.5 eITO传感器用于生物标记物的电化学检测 |
| 3.2.6 eITO传感器用于有机染料荧光增强 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 eITO传感器的优化 |
| 3.3.2 eITO传感器的表征 |
| 3.3.3 eITO/Tf/BSA传感器用于TfR的电化学检测的结果分析 |
| 3.3.4 eITO传感器用于有机染料荧光增强的结果分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于磁性纳米粒子的单细胞代谢组学的质谱检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 单细胞代谢组学的检测意义 |
| 4.1.2 单细胞代谢组学的检测方法 |
| 4.1.3 激光捕获显微切割技术 |
| 4.1.4 宫颈癌 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂与材料 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.2.3 He La细胞的培养及细胞甩片制备 |
| 4.2.4 宫颈癌组织冷冻切片的制备和染色 |
| 4.2.5 细胞甩片和冷冻切片的显微切割 |
| 4.2.6 基质辅助激光解吸电离质谱的检测 |
| 4.2.7 质谱数据分析 |
| 4.2.8 潜在生物标记物的筛选 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 方法的验证 |
| 4.3.2 LCM联用MALDI MS对宫颈癌单细胞的代谢组学分析结果 |
| 4.3.3 潜在生物标记物的筛选 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要工作与创新点 |
| 5.2 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（7）胎牛空肠隐窝干细胞分离、鉴定及传代培养（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IESC的起源、发生 |
| 2 小肠干细胞的概念、位置和数量 |
| 3 小肠干细胞的微环境 |
| 4 小肠干细胞的特异性标记物 |
| 5 小肠干细胞的信号通路 |
| 6 肠隐窝干细胞的来源 |
| 7 小肠干细胞Bmi1和Lgr5的表达 |
| 第二章 胎牛空肠隐窝干细胞的定位、分离培养和鉴定 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要溶液配制 |
| 1.3 试验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 透射电子显微镜的观察 |
| 2.2 扫描电子显微镜的观察 |
| 2.3 石蜡切片HE染色 |
| 2.4 空肠隐窝干细胞分离培养 |
| 2.5 空肠隐窝干细胞的传代培养 |
| 2.6 胎牛空肠隐窝干细胞的复苏效果 |
| 2.7 原代胎牛空肠隐窝干细胞的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 不同分离方法对胎牛空肠隐窝干细胞的影响 |
| 3.2 不同FBS浓度的空肠隐窝干细胞培养 |
| 3.3 胎牛空肠隐窝干细胞冻存、复苏的影响因素 |
| 4. 小结 |
| 第三章 不同添加物对胎牛空肠隐窝干细胞的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要溶液配制 |
| 1.3 试验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 细胞划痕 |
| 2.2 不同浓度LPS、VD、EGF对空肠隐窝干细胞的影响 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 肠干细胞的特异性标记物“Lgr5” |
| 3.2 细胞培养添加物及其不同浓度对空肠隐窝干细胞的影响 |
| 4. 小结 |
| 第四章 体外3D培养的初步研究 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要溶液配制 |
| 1.3 试验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度基质胶的筛选 |
| 2.2 成肌纤维细胞的分离培养 |
| 2.3 成肌纤维细胞的传代培养 |
| 2.4 成肌纤维细胞的复苏效果 |
| 2.5 隐窝分离及类器官培养 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 基质胶在类器官中的作用 |
| 3.2 类器官的培养 |
| 4. 小结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（8）多功能小分子基因载体的构建及其基因递送行为的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 基因治疗的研究进展 |
| 1.2 常见基因治疗类型 |
| 1.2.1 基于DNA的基因治疗 |
| 1.2.2 基于RNA的基因治疗 |
| 1.3 基因传递的基本过程与挑战 |
| 1.3.1 血液循环 |
| 1.3.2 细胞内吞 |
| 1.3.3 内涵体逃逸 |
| 1.3.4 基因释放 |
| 1.4 非病毒基因递送体系的概述 |
| 1.4.1 脂质体 |
| 1.4.2 聚阳离子 |
| 1.4.3 小分子载体 |
| 1.5 课题的提出及研究内容 |
| 第2章 一种启发于病毒具有自指示荧光特性的小分子基因载体的构建及应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料和试剂 |
| 2.2.2 TR4 的制备 |
| 2.2.3 TR4 纯度及分子量的测定 |
| 2.2.4 pDNA@TR4复合物的制备 |
| 2.2.5 TR4 压缩pDNA能力的测定 |
| 2.2.6 TR4 保护pDNA能力的测定 |
| 2.2.7 胚胎干细胞(R1)的培养 |
| 2.2.8 pDNA@TR4 在多种细胞中的基因转染效率的测定 |
| 2.2.9 细胞毒性 |
| 2.2.10 pDNA@TR4 在细胞内的分布及成像 |
| 2.2.11 pDNA@TR4 的细胞内吞方式 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 TR4 的合成与表征 |
| 2.3.2 TR4 核酸压缩能力的表征 |
| 2.3.3 pDNA@TR4 稳定性研究 |
| 2.3.4 pDNA@TR4 组装形貌以及荧光特性的研究 |
| 2.3.5 pDNA@TR4 细胞转染的研究 |
| 2.3.6 pDNA@TR4 细胞毒性的研究 |
| 2.3.7 TR4 细胞水平递送基因过程的研究 |
| 2.3.8 pDNA@TR4 细胞内吞方式的研究 |
| 2.4 本章结论 |
| 第3章 一种转铁蛋白包覆的具有类病毒转染特性载体的构建及其siRNA递送行为的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 TR4 的制备与表征 |
| 3.2.3 TR4@siRNA@Tf三元复合物的制备 |
| 3.2.4 TR4@siRNA@Tf三元复合物的表征 |
| 3.2.5 细胞培养 |
| 3.2.6 细胞毒性 |
| 3.2.7 基因沉默 |
| 3.2.8 细胞内吞效率的检测 |
| 3.2.9 细胞内分布的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 TR4 最佳使用浓度的筛选 |
| 3.3.2 TR4 压缩siRNA能力的表征 |
| 3.3.3 TR4@siRNA理化性质的表征 |
| 3.3.4 TR4@siRNA的基因沉默效率以及细胞毒性表征 |
| 3.3.5 TR4@siRNA@Tf的制备及理化性质的表征 |
| 3.3.6 TR4@siRNA@Tf在血清中的稳定性评价 |
| 3.3.7 TR4@siRNA@BSA的制备及其理化性质的表征 |
| 3.3.8 TR4@siRNA@Tf的细胞毒性及基因沉默效率 |
| 3.3.9 TR4@siRNA@Tf的细胞内吞效率 |
| 3.3.10 TR4@siRNA@Tf在细胞中基因递送过程的研究 |
| 3.3.11 TR4@siRNA@Tf促进siRNA释放的机制研究 |
| 3.3.12 TR4@siRNA@Tf实现快速的基因沉默 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 一种具有抗血清能力的氟化寡聚聚乙烯亚胺纳米组装体的构建及其抗血清机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验步骤 |
| 4.2.1 实验原料与仪器 |
| 4.2.2 氟化寡聚聚乙烯亚胺的合成 |
| 4.2.3 烷基化寡聚聚乙烯亚胺的合成 |
| 4.2.4 茚三酮方法 |
| 4.2.5 纳米组装体及其与siRNA复合物的制备 |
| 4.2.6 纳米组装体的粒径及形貌测定 |
| 4.2.7 临界胶束浓度(CMC) |
| 4.2.8 细胞毒性 |
| 4.2.9 基因沉默 |
| 4.2.10 细胞内吞效率的测定 |
| 4.2.11 细胞内分布的测定 |
| 4.2.12 纳米组装体在血清中的尺寸稳定性 |
| 4.2.13 纳米组装体在血清中吸附蛋白量的测定 |
| 4.2.14 纳米组装体在动物体内的分布测定 |
| 4.2.15 体内ApoB蛋白沉默的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 fOEI的合成与表征 |
| 4.3.2 fOEI纳米组装体及fOEI/siRNA复合物的制备与表征 |
| 4.3.3 fOEI纳米组装体基因沉默能力的表征 |
| 4.3.4 fOEI纳米组装体抗血清机制研究 |
| 4.3.5 血清对aOEI-C12与f_(0.7)OEI纳米组装体细胞转染过程影响的研究 |
| 4.3.6 血清对aOEI-C12与f_(0.7)OEI纳米组装体稳定性影响的研究 |
| 4.3.7 aOEI-C12与f_(0.7)OEI纳米组装体体内分布的研究 |
| 4.3.8 aOEI-C12与f_(0.7)OEI纳米组装体体内沉默ApoB蛋白的表征 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 全文总结 |
| 5.1 研究成果 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 后续研究工作的展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（9）碳基纳米材料的制备及其生物效应研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 碳基纳米材料 |
| 1.1 富勒烯 |
| 1.2 富勒醇 |
| 1.3 石墨烯量子点 |
| 2 纳米材料的生物效应 |
| 2.1 纳米材料与蛋白分子的相互作用 |
| 2.2 纳米材料与自噬 |
| 2.3 纳米材料与线粒体的相互作用 |
| 3 本论文的选题思路、意义及主要创新 |
| 3.1 本论文的选题思路和意义 |
| 3.2 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 第二章 水溶性富勒烯与转铁蛋白的相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验试剂与仪器 |
| 2.1 化学试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 溶液配制 |
| 3 实验方法及步骤 |
| 3.1 水溶性C60的制备及表征 |
| 3.2 水溶性C60浓度的确定 |
| 3.3 C60-甲苯溶液标准曲线 |
| 3.4 荧光光谱测定 |
| 3.5 圆二色谱测定 |
| 3.6 等温滴定微量热测量 |
| 4 实验结果与讨论 |
| 4.1 Nano-C60的表征 |
| 4.2 Nano-C60的浓度 |
| 4.3 Nano-C60与Tf的荧光猝灭机制及猝灭常数 |
| 4.4 Nano-C60和Tf间的作用力类型 |
| 4.5 Nano-C60对Tf构象的影响 |
| 4.6 Nano-C60与Tf相互作用的热力学分析 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 富勒醇与血清蛋白的相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验试剂与仪器 |
| 2.1 化学试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 溶液配制 |
| 3 实验方法及步骤 |
| 3.1 富勒醇的制备及表征 |
| 3.2 富勒醇与血清蛋白的相互作用 |
| 4 实验结果与讨论 |
| 4.1 富勒醇的表征 |
| 4.2 荧光猝灭机制及猝灭常数 |
| 4.3 富勒醇对血清蛋白构象的影响 |
| 4.4 富勒醇与血清蛋白相互作用的热力学参数 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 富勒醇与细胞的相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 溶液配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 血清剥夺增强富勒醇的细胞毒性 |
| 3.2 细胞摄取富勒醇不受血清影响 |
| 3.3 细胞内ROS的检测 |
| 3.4 富勒醇促进自噬体的积累 |
| 3.5 富勒醇阻碍自噬体降解 |
| 3.6 富勒醇影响溶酶体功能 |
| 3.7 3-MA对饥饿条件下细胞死亡的作用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 富勒醇与离体线粒体的相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与仪器 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 化学试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 缓冲溶液 |
| 3 实验方法及步骤 |
| 3.1 大鼠肝脏离体线粒体的提取 |
| 3.2 线粒体肿胀实验 |
| 3.3 线粒体膜电势的测定 |
| 3.4 线粒体膜流动性的测定 |
| 3.5 线粒体呼吸耗氧的测定 |
| 3.6 线粒体超微结构的检测 |
| 3.7 统计分析 |
| 4 实验结果与讨论 |
| 4.1 富勒醇对线粒体肿胀的影响 |
| 4.2 富勒醇对线粒体膜电势的影响 |
| 4.3 富勒醇对线粒体内膜H~+、K~+通透性的影响 |
| 4.4 富勒醇对线粒体呼吸作用的影响 |
| 4.5 富勒醇对线粒体膜流动性的影响 |
| 4.6 富勒醇对MPT的影响 |
| 4.7 富勒醇对线粒体超微结构的影响 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 石墨烯量子点与细胞的相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 溶液配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 GQDs的表征 |
| 3.2 GQDs的细胞活性 |
| 3.3 GQDs的细胞摄入 |
| 3.4 GQDs对自噬的影响 |
| 3.5 GQDS对自噬流的影响 |
| 3.6 GQDs对H202诱导的细胞毒性的保护作用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录: 博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）金属蛋白制备及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 金属蛋白 |
| 1.2 转铁蛋白的应用前景及其制备方法 |
| 1.2.1 转铁蛋白的结构、功能 |
| 1.2.2 转铁蛋白的应用 |
| 1.2.3 转铁蛋白的制备 |
| 1.3 超氧化物歧化酶的应用前景及其制备方法 |
| 1.3.1 自由基 |
| 1.3.2 超氧化物歧化酶的功能 |
| 1.3.3 超氧化物歧化酶的分类及分布 |
| 1.3.4 超氧化物歧化酶的应用 |
| 1.3.5 超氧化物歧化酶的制备 |
| 1.3.6 超氧化物歧化酶活性检测方法 |
| 1.3.7 超氧化物歧化酶比活测试方法 |
| 1.3.8 超氧化物歧化酶的性质 |
| 1.4 超氧化物歧化酶模拟化合物 |
| 1.4.1 槲皮素 |
| 1.4.2 槲皮素金属配合物 |
| 1.5 研究意义和主要内容 |
| 1.5.1 课题背景和意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 鸭血清转铁蛋白的提取 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 化学试剂及仪器 |
| 2.1.2 鸭血清样品制备 |
| 2.1.3 热激与硫酸铵沉淀耦合法提取鸭血清转铁蛋白粗品 |
| 2.1.4 硫酸铵分级沉淀法提取鸭血清转铁蛋白粗品 |
| 2.1.5 固定化铜离子亲和膜层析柱的制备 |
| 2.1.6 固定化铜离子亲和膜层析柱纯化鸭血清转铁蛋白粗品 |
| 2.1.7 鸭血清转铁蛋白活性测定 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 热激与硫酸铵沉淀耦合法提取鸭血清转铁蛋白粗品的影响因素 |
| 2.2.2 硫酸铵分级沉淀提取鸭血清转铁蛋白粗品 |
| 2.2.3 亲和膜色谱柱吸附鸭血清转铁蛋白的影响因素 |
| 2.2.4 鸭血清转铁蛋白的活性及纯度鉴定 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 超氧化物歧化酶活性检测方法 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 化学试剂及仪器 |
| 3.1.2 主要试剂配制 |
| 3.1.3 联大茴香胺检测SOD活性的正交实验设计 |
| 3.1.4 光照时间单因素实验 |
| 3.1.5 核黄素浓度单因素实验 |
| 3.1.6 联大茴香胺盐酸盐浓度单因素实验 |
| 3.1.7 联大茴香胺法测定SOD酶活 |
| 3.2 结果及讨论 |
| 3.2.1 检测SOD酶活的正交实验结果 |
| 3.2.2 光照时间对SOD酶活检测的影响 |
| 3.2.3 核黄素浓度对SOD酶活检测的影响 |
| 3.2.4 联大茴香胺盐酸盐浓度对SOD酶活检测的影响 |
| 3.2.5 联大茴香胺法检测SOD酶活的工作曲线 |
| 3.2.6 南瓜瓤、南瓜果肉、南瓜籽和大蒜样品的SOD含量 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 凝胶过滤层析和离子交换层析纯化南瓜瓤超氧化物歧化酶 |
| 4.1 方法 |
| 4.1.1 化学试剂及仪器 |
| 4.1.2 南瓜瓤样品制备 |
| 4.1.3 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 |
| 4.1.4 浸提 |
| 4.1.5 热激 |
| 4.1.6 硫酸铵沉淀 |
| 4.1.7 凝胶过滤层析 |
| 4.1.8 阴离子交换层析 |
| 4.1.9 变性电泳 |
| 4.1.10 非变性电泳 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 考马斯亮蓝法测试蛋白质含量的工作曲线 |
| 4.2.2 粗酶液浸提条件优化 |
| 4.2.3 热激时间对南瓜瓤SOD纯化的影响 |
| 4.2.4 浓缩南瓜瓤SOD的硫酸铵饱和度 |
| 4.2.5 凝胶过滤层析纯化南瓜瓤SOD |
| 4.2.6 阴离子交换层析纯化南瓜瓤SOD |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 亲和层析纯化南瓜瓤超氧化物歧化酶 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 化学试剂及仪器 |
| 5.1.2 硫酸铵沉淀法 |
| 5.1.3 热激与硫酸铵沉淀耦合法 |
| 5.1.4 固定化铜离子亲和微晶纤维素的制备 |
| 5.1.5 亲和层析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 硫酸铵沉淀法去除粗酶液的杂蛋白 |
| 5.2.2 热激与硫酸铵沉淀耦合法去除粗酶液的杂蛋白 |
| 5.2.3 亲和层析纯化南瓜瓤SOD |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 南瓜瓤超氧化物歧化酶的性质 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 化学试剂及仪器 |
| 6.1.2 南瓜瓤SOD中金属含量测试 |
| 6.1.3 温度对南瓜瓤SOD酶活的影响 |
| 6.1.4 pH酸碱性对南瓜瓤SOD酶活的影响 |
| 6.1.5 化学试剂对南瓜瓤SOD酶活的影响 |
| 6.1.6 凝胶电泳测试南瓜瓤SOD分子量 |
| 6.1.7 透析 |
| 6.1.8 质谱测试南瓜瓤SOD分子量 |
| 6.1.9 凝胶过滤层析测试南瓜瓤SOD分子量 |
| 6.1.10 苔黑酚-硫酸显色实验 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 南瓜瓤SOD的类别 |
| 6.2.2 南瓜瓤SOD的热稳定性 |
| 6.2.3 南瓜瓤SOD 的pH稳定性 |
| 6.2.4 南瓜瓤SOD对化学试剂的敏感性 |
| 6.2.5 南瓜瓤SOD的分子量 |
| 6.2.6 南瓜瓤SOD是糖蛋白 |
| 6.3 本章小结 |
| 第七章 超氧化物歧化酶模拟酶的合成 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 化学试剂及仪器 |
| 7.1.2 槲皮素金属配合物的合成方法 |
| 7.1.3 槲皮素铜配合物中铜离子含量的测定 |
| 7.1.4 槲皮素锌配合物中锌离子含量的测定 |
| 7.1.5 槲皮素铜及槲皮素锌配合物的红外检测 |
| 7.1.6 槲皮素铜及槲皮素锌配合物的紫外检测 |
| 7.1.7 槲皮素铜及槲皮素锌配合物的SOD活性测试 |
| 7.2 结果与讨论 |
| 7.2.1 槲皮素铜配合物合成条件优化 |
| 7.2.2 槲皮素锌配合物合成条件优化 |
| 7.2.3 槲皮素铜及槲皮素锌配合物的红外分析 |
| 7.2.4 槲皮素铜及槲皮素锌配合物的的紫外分析 |
| 7.3 本章小结 |
| 第八章 全文总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、牦牛血清转铁蛋白的制备及应用——转铁蛋白在无血清细胞培养中的应用（论文参考文献）
- [1]鸡蛋卵转铁蛋白模拟胃肠消化产物的致敏性[D]. 王靖舒. 南昌大学, 2021
- [2]C-反应蛋白的血液-组织交换机制研究[D]. 刘雨桐. 兰州大学, 2021(09)
- [3]卵转铁蛋白抗菌肽的制备及纳米粒应用研究[D]. 马斌. 华中农业大学, 2021
- [4]两种心肌损伤标志物的免疫活性浓度准确定量方法研究[D]. 胡婷婷. 北京化工大学, 2020(02)
- [5]基于磷酰胆碱的载药体系的构建及肿瘤治疗研究[D]. 龙丽霞. 天津大学, 2020(01)
- [6]功能化纳米材料的生物传感在疾病生物标志物检测中的应用[D]. 刘锡源. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]胎牛空肠隐窝干细胞分离、鉴定及传代培养[D]. 石亚珂. 河南农业大学, 2019(04)
- [8]多功能小分子基因载体的构建及其基因递送行为的研究[D]. 张廷斌. 天津大学, 2018(06)
- [9]碳基纳米材料的制备及其生物效应研究[D]. 杨立云. 武汉大学, 2017(06)
- [10]金属蛋白制备及性质研究[D]. 秦晓蓉. 武汉科技大学, 2012(01)