Anxa1基因敲除和过表达小鼠的制备及其对小鼠毛囊生长影响的初步探究

论文摘要

膜联蛋白1（Anxa1）是一种钙依赖的磷脂结合蛋白,在动物、植物、微生物中均有表达,参与多种细胞生理活动。由于小鼠背部皮肤组织中Anxa1基因的表达随着毛囊生长周期的变化而变化,我们推测Anxa1可能是影响毛囊生长发育的关键因子。为了探究Anxa1基因对小鼠毛囊生长发育的影响,本研究通过CRISPR/Cas9技术体系结合显微注射技术制备Anxa1基因的敲除（knockout,KO）和过表达（overexpression,OE）小鼠;通过脱毛诱导实验比较小鼠背部毛发生长的速度;通过组织切片的显微观察统计小鼠背部皮肤组织中毛囊的密度和直径;通过纤维细度仪测量小鼠毛干的直径。通过免疫荧光染色检测小鼠毛囊中Ki-67、CD34的分布;通过qRT-PCR或Western Blot检测小鼠背部皮肤组织中Egf、Notch1、Mkk7的表达水平;通过Western Blot检测小鼠背部皮肤中Akt1、Erk1/2的磷酸化水平。本研究利用CRISPR/Cas9技术体系结合显微注射技术制备Anxa1 KO与OE小鼠,获得4只KO小鼠和5只OE小鼠,阳性率分别为为19.0%和20.8%。10周龄小鼠脱毛诱导13天后,发现KO小鼠背部已经长出浓密的毛发,未经遗传修饰的原生型（WT）小鼠和OE小鼠背部毛发较短。10周龄KO小鼠的毛囊数量（33.6±0.5）略多于WT小鼠（33±1.2）,OE小鼠的毛囊数量（27±0.7）少于WT小鼠（33±1.2）（P<0.05）。P70鼠龄KO小鼠背部皮肤组织中毛囊的直径（43.28±2.27μm）大于WT小鼠（35.76±2.11μm）（P<0.05）,OE小鼠背部皮肤组织中毛囊的直径（33.35±2.17μm）小于WT小鼠（35.76±2.11μm）。KO、OE和WT小鼠的毛干直径分别为21.12±1.18μm、19.24±1.87μm、19.92±1.32μm,KO小鼠背部的毛干直径大于WT小鼠（P<0.05）,OE小鼠背部的毛干直径小于WT小鼠。P35鼠龄KO、OE小鼠与WT小鼠的毛囊直径分别为92.29±3.22μm、73.71±2.92μm、80.57±1.36μm,KO小鼠的毛囊直径大于WT小鼠（P<0.05）,OE小鼠毛囊的直径小于WT小鼠。在P35鼠龄小鼠中,KO小鼠的整个毛囊中都有Ki-67、CD34蛋白的聚集,而在OE和WT小鼠中Ki-67、CD34蛋白主要聚集在毛囊的内根鞘和外根鞘中。在P70鼠龄小鼠中,Ki-67、CD34蛋白在KO、OE和WT小鼠毛囊中的聚集都很低。在P35鼠龄小鼠的背部皮肤组织中,KO小鼠的Egf、Notch1、Mkk7 mRNA的相对表达量高于WT小鼠,分别是其2.15倍、19倍（P<0.05）、2.78倍（P<0.05）;OE小鼠的Egf、Notch1、Mkk7mRNA的相对表达量低于WT小鼠,分别是其0.36倍（P<0.05）、0.28倍、0.48倍。在P70鼠龄小鼠背部皮肤组织中,KO小鼠的Egf、Notch1、Mkk7 mRNA的相对表达量高于WT小鼠,分别是其3.09倍（P<0.05）、3.98倍、1.47倍,OE小鼠的Egf、Notch1、Mkk7 mRNA的相对表达量低于WT小鼠,分别是其0.16倍（P<0.05）、0.40倍、0.57倍。KO小鼠的Akt1、Erk1/2蛋白磷酸化水平高于WT小鼠,是其2.67倍（P<0.05）、1.78倍（P<0.05）;OE小鼠的Akt1、Erk1/2磷酸化水平低于WT小鼠,是其0.69倍、0.8倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
•   1.Anxa1 的背景介绍
•     1.1 Anxa1 基因的结构与表达
•     1.2 Anxa1 蛋白质结构与功能
•     1.3 Anxa1 与炎症反应
•     1.4 Anxa1 与细胞增殖的关系
•     1.5 Anxa1 与细胞凋亡的关系
•     1.6 Anxa1 与癌症
•     1.7 Anxa1 与血脑屏障
•     1.8 Anxa1 与骨骼肌的损伤修复
•     1.9 Anxa1 与毛囊发育
•     1.10 Anxa1 的展望
•   2 CRISPR/Cas系统介绍
•     2.1 基因编辑技术的简介
•     2.2 CRISPR/Cas系统的基因座结构
•     2.3 CRISPR/Cas9 系统的工作原理
•     2.4 CRISPR/Cas9 系统的展望与未来
• 第二部分 实验研究
•   第一章 Anxa1 基因敲除与过表达小鼠的制备与鉴定
•     1 引言
•     2 材料
•       2.1 主要仪器设备
•       2.2 实验动物
•       2.3 外源基因
•       2.4 主要试剂
•     3 实验方法
•       3.1 Anxa1 KO和 OE载体的构建与活性检测
•     3.1.1 Anxa1-KO载体的构建
•     3.1.2 Anxa1-OE载体的构建
•       3.2 Anxa1 KO和 OE小鼠的制备
•       3.3 Anxa1 KO小鼠的PCR检测
•       3.4 Anxa1 KO纯合小鼠的判定
•       3.5 Anxa1 OE小鼠的PCR检测
•       3.6 总RNA的提取
•       3.7 Anxa1 KO和 OE小鼠的建系
•       3.8 实时荧光定量PCR
•       3.9 小鼠生长曲线的测量
•       3.10 数据统计分析
•     4 实验结果
• 0代Anxa1 基因敲除小鼠PCR鉴定结果'>      4.1 F₀代Anxa1 基因敲除小鼠PCR鉴定结果
• 0代Anxa1 基因敲除小鼠测序鉴定结果'>      4.2 F₀代Anxa1 基因敲除小鼠测序鉴定结果
• 0代Anxa1 OE小鼠PCR鉴定结果'>      4.3 F₀代Anxa1 OE小鼠PCR鉴定结果
•       4.4 Anxa1 KO和 OE小鼠的建系
•       4.5 KO小鼠Anxa1 mRNA表达水平的检测
•       4.6 OE小鼠Anxa1 mRNA表达水平的检测
•       4.7 OE小鼠各组织中Anxa1 mRNA表达水平的检测
•       4.8 Anxa1 基因对小鼠产仔数、体重和性别比例的影响
•     5 讨论
•   第二章 Anxa1 基因对小鼠毛囊生长的影响
•     1 引言
•     2 材料
•       2.1 主要仪器设备
•       2.2 活体材料
•       2.3 主要试剂
•     3 实验方法
•       3.1 人工脱毛—诱导毛发进入生长期
•       3.2 实时荧光定量PCR
•       3.3 Anxa1 及其下游信号蛋白的Western Blot检测
•       3.4 石蜡切片的制备
•       3.5 H&E染色
•       3.6 免疫荧光染色
•       3.7 数据分析
•     4 实验结果
•       4.1 小鼠各组织中Anxa1 表达水平的检测
•       4.2 Anxa1 基因在小鼠背部皮肤组织毛囊周期中的表达分析
•       4.3 Anxa1 蛋白在小鼠背部皮肤组织毛囊周期中的表达定位
•       4.4 脱毛实验观察小鼠皮肤毛发再生情况
•       4.5 HE染色观察Anxa1 基因对小鼠毛囊数量的影响
•       4.6 Anxa1 基因对休止期小鼠毛囊生长的影响
•       4.7 Anxa1 基因对生长期小鼠毛囊生长的影响
•       4.8 Ki-67和CD34 的免疫荧光染色观察
•       4.9 Anxa1对Egf表达的影响
•       4.10 Anxa1对Notch1 表达的影响
•       4.11 Anxa1对Mkk7 表达的影响
•       4.12 Anxa1对Akt1和Erk1/2 磷酸化的影响
•     5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张豪

导师: 郭旭东

关键词: 敲除小鼠,过表达小鼠,毛囊,信号通路

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学

分类号: Q78

总页数: 81

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