供核细胞端粒酶活性对体细胞重编程表观遗传修饰的影响

论文摘要

卵子能够100%重编程已经定向分化的精子细胞核,但不能完全重编程体细胞核。作为供核细胞,二者的显著区别是:体细胞没有端粒酶活性,精子细胞的端粒酶活性存在时序性变化。基于此,本研究拟通过腺病毒携带端粒酶基因制备牛乳腺细胞体外研究模型,命名hTERT-bMGEs,它可以模拟精子细胞成熟过程端粒酶活性的变化,以hTERT-bMGEs为供核细胞,探究当供核细胞端粒酶活性发生类似精子细胞成熟过程的变化时,其表观修饰变化是否接近正常受精胚,卵子是否能提高体细胞重编程效率?本研究目的是通过阐明供体细胞端粒酶时序性变化与体细胞核重编程的互作机制,为体细胞重编程的理论及应用研究提供一种新思路。相关研究与结果如下:1.利用重组腺病毒AdEasy-1体系构建含端粒酶催化亚基（hTERT）的腺病毒载体,分别用电转法、脂质体法进行转染,并结合不同的血清浓度包装293A细胞进行病毒包装条件的优化,进一步通过感染体外分离培养的小鼠成纤维细胞验证端粒酶是否能够成功表达。结果表明,携带hTERT基因的重组腺病毒载体构建成功,其病毒包装最优条件是:脂质体法+15%（v/v）的胎牛血清,由此获得病毒滴度最高达1×1011IFU/mL;进一步通过RT-PCR和荧光检测证实端粒酶基因在小鼠成纤维细胞中能够成功表达,可用于后续制备牛乳腺细胞体外研究模型。2.体外分离纯化牛乳腺上皮细胞并进行生物学特征的鉴定。结果表明:首次尝试一种“二次选择性组织块贴壁法”进行乳腺上皮细胞分离纯化,其获得的乳腺细胞纯度为100%,细胞活力较好,且在体外能稳定维持乳腺上皮细胞的正常生物学特性,进一步发现此方法获得的单克隆显著多于对照组。本研究为乳腺细胞体外研究模型的建立提供了一个有效的方法。3.利用携带端粒酶基因的重组腺病毒感染牛乳腺上皮细胞,筛选阳性细胞并进行鉴定。结果表明:成功制备牛乳腺细胞体外研究模型hTERT-bMGEs,且通过比较携带端粒酶基因的质粒载体pCI-neo-hTERT和pEGFP-hTERT与腺病毒载体的转染效率和阳性克隆率,表明腺病毒转染效率显著高于质粒载体,是制备细胞研究模型的最适途径。4.以精子细胞为对照,通过对阳性细胞端粒酶活性分析,筛选出最适模型制作体细胞克隆胚,通过对克隆胚卵裂率、囊胚发育率和X染色体失活、印记基因H19、IGF2表达量的检测与分析,探究端粒酶活性对体细胞重编程效率及表观遗传修饰的影响。结果表明:第13代hTERT-bMGEs为核移植的最适供核模型,获得的克隆胚卵裂率和囊胚发育率显著虽显著低于体外受精胚,但显著高于非转端粒酶基因的供核细胞获得的克隆胚,且hTERT-bMGEs组获得4-细胞期克隆胚印记基因H19、IGF2和X染色体失活相关基因XIST的表达量均显著低于对照组;初步结果表明当供核细胞端粒酶活性发生类似精子细胞成熟过程的变化时,卵子能够提高体细胞重编程效率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
•   1.1 牛乳腺上皮细胞的研究进展
•     1.1.1 牛乳腺上皮细胞的体外分离纯化
•     1.1.2 牛乳腺上皮细胞系的研究进展
•     1.1.3 问题与展望
•   1.2 端粒酶的最新研究进展
•     1.2.1 端粒酶的最新结构
•     1.2.2 端粒酶的调控机制
•   1.3 体细胞核重编程的研究进展
•     1.3.1 体细胞重编程的表观遗传调控
•     1.3.2 细胞重编程的方法
•   1.4 端粒酶调控体细胞核重编程
•     1.4.1 端粒酶调控端粒重编程
•     1.4.2 端粒酶调控体细胞重编程
•   1.5 问题与展望
•   1.6 技术路线
• 2 携带端粒酶基因的腺病毒载体构建、包装及表达
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 试验材料
•     2.1.2 重组腺病毒载体构建
•     2.1.3 病毒包装和滴度测定
•     2.1.4 包装条件优化
•     2.1.5 r Ad-h TERT感染成纤维细胞
•     2.1.6 RT-PCR鉴定r Ad-h TERT表达
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 重组腺病毒载体构建
•     2.2.2 重组腺病毒包装
•     2.2.3 重组腺病毒包装条件的优化
•     2.2.4 rAd-hTERT感染成纤维细胞的特征
•     2.2.5 RT-PCR鉴定rAd-hTERT表达
•   2.3 讨论
•   2.4 本章小结
• 3 牛乳腺上皮细胞的体外分离纯化及生物学特征鉴定
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 bMGEs的分离培养
•     3.1.4 bMGEs的纯化
•     3.1.5 纯化后的b MGEs的细胞生物学鉴定
•     3.1.6 纯化后的b MGEs纯度检测
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 bMGEs的分离纯化方法比较
•     3.2.2 bMGEs细胞生物学特征分析鉴定
•     3.2.3 bMGEs的纯度鉴定
•   3.3 讨论
•   3.4 本章小结
• 4 转端粒酶基因牛乳腺上皮细胞体外研究模型的制备
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 载体和菌株
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 牛乳腺上皮细胞的复苏及传代培养
•     4.1.4 牛乳腺上皮细胞的转染及阳性克隆的筛选
•     4.1.5 阳性细胞端粒酶活性检测
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 牛乳腺细胞体外研究模型h TERT-b MGEs的鉴定
•     4.2.2 bMGEs转染效率与阳性克隆率
•     4.2.3 阳性细胞端粒酶活性检测
•   4.3 讨论
•   4.4 本章小结
• 5 端粒酶调控体细胞重编程效率的初步鉴定
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 主要试剂
•     5.1.2 卵母细胞的成熟
•     5.1.3 核移植及体外受精卵的制备
•     5.1.4 核质融合、重组胚的激活与体外培养
•     5.1.5 克隆胚表观遗传修饰检测
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 克隆胚的制备
•     5.2.2 克隆胚的发育率统计
•     5.2.3 克隆胚表观遗传修饰基因的PCR鉴定
•     5.2.4 克隆胚表观遗传修饰基因的表达水平检测
•   5.3 讨论
•   5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 在学研究成果
• 致谢
• 附录A 主要仪器

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 荆乾鸽

导师: 贺小英,马利兵

关键词: 端粒酶,腺病毒,牛乳腺上皮细胞,体细胞重编程,表观遗传修饰

来源: 内蒙古科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 内蒙古科技大学

基金: 国家自然基金“供体细胞端粒酶活性时序性变化与体细胞核重编程互作机制的研究(项目编号:31560331)”

分类号: Q75

DOI: 10.27724/d.cnki.gnmgk.2019.000292

总页数: 62

文件大小: 1888K

下载量: 36