Aβ蛋白寡聚体特异性单域抗体的筛选、表达及其鉴定

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimers disease,AD）是一种发生在人类老年阶段的持续性高级神经功能活动障碍的原发性退行性脑病。其病理变化主要表现为大脑皮质层的萎缩,同时并伴有β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）沉积和神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFT）,记忆性神经元变性坏死及数目大量减少,以致老年斑（Senile plaque,SP）的形成。Aβ蛋白在大脑皮质细胞外间隙和脑血管壁中的沉积是AD神经病理学的标志。目前,AD的发病机制和药物研发方面取得了良好的进展,特别是针对Aββ寡聚体的影像学诊断已成为AD治疗极具效果的手段。本试验研究用Aβ寡聚体免疫双峰驼,分离外周血淋巴细胞,通过RT-PCR技术,得到重链抗体的可变区（VHH）,成功构建了库容为1×107的初级Aβ单域抗体库。然后再以噬菌体展示技术对抗体库进行筛选,利用ELISA法筛选特异性识别Aβ寡聚体的阳性克隆株,在Transetta-DE3感受态细胞中加入Aβ连接pET-25b-SBP,在进行可溶性表达和蛋白纯化。SDS-PAGE分析结果显示Aβ抗体以可溶性的形式获得了正确的表达,且成功进行了纯化。ELISA结果表明,重组表达的Aβ抗体具有对Aβ寡聚体特异性结合活性。因此,本试验应用噬菌体展示技术,成功构建Aβ噬菌体抗体基因抗体库,同时获得特异性强、表达量高的Aβ寡聚体特异性单域抗体,为阿尔茨海默病的临床诊断和治疗研究提供新的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 引言
•   1.1 阿尔茨海默病概述
•     1.1.1 致病机理
•     1.1.2 临床症状
•     1.1.3 诊断与预防
•     1.1.4 国内外AD免疫治疗的研究现状和发展趋势
•   1.2 抗体概述
•     1.2.1 抗体结构
•     1.2.2 单域抗体
•   1.3 噬菌体展示技术与噬菌体抗体库
•     1.3.1 噬菌体展示技术
•     1.3.2 噬菌体抗体库的筛选
•     1.3.3 噬菌体抗体库技术展望
•   1.4 研究目的及意义
• 2 试验一 抗Aβ寡聚体单域抗体库构建
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 试验动物
• 1-42肽'>    2.1.2 Aβ_1-42肽
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 培养基和缓冲液的配制
•     2.1.5 试验仪器和设备
•     2.1.6 PCR引物
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 骆驼的免疫
•     2.2.2 血清抗体效价的测定
•     2.2.3 采集骆驼全血
•     2.2.4 外周血淋巴细胞分离
•     2.2.5 总RNA提取
•     2.2.6 反转录合成cDNA
•     2.2.7 单域抗体基因的扩增
•     2.2.8 VHH片段的酶切
•     2.2.9 pCANTAB5e载体的制备
•     2.2.10 VHH片段与pCANTAB5e载体连接
•     2.2.11 电转化感受态大肠杆菌TG1
•     2.2.12 抗体库的初步鉴定
•   2.3 结果
•     2.3.1 血清抗体效价ELISA鉴定结果
•     2.3.2 Aβ单域抗体基因的扩增结果
•     2.3.3 pCANTAB5e质粒酶切结果
•     2.3.4 抗体库的鉴定
•   2.4 讨论
• 3 试验二 Aβ特异性单域抗体的富集和筛选
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 实验试剂
•     3.1.2 主要培养基和缓冲液配制方法
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 Aβ单域抗体的富集和筛选
•     3.2.2 Phage ELISA鉴定阳性克隆
•   3.3 结果
•     3.3.1 辅助噬菌体M13K07复壮滴度结果
•     3.3.2 Aβ特异性单域抗体的富集和筛选结果
•     3.3.3 重组噬菌体单域抗体ELISA鉴定结果
•   3.4 讨论
• 4 试验三 Aβ特应性单域抗体的诱导表达、纯化及鉴定
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 Aβ单域抗体
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 培养基和缓冲液的配制
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 重组质粒的构建
•     4.2.2 Aβ单域抗体的表达及纯化
•   4.3 结果
•     4.3.1 Aβ单域抗体基因扩增结果
•     4.3.2 表达质粒和表达载体质粒的酶切结果
•     4.3.3 重组质粒菌落鉴定结果
•     4.3.4 菌体破碎SDS-PAGE结果
•     4.3.5 菌体破碎ELISA结果
•     4.3.6 纯化蛋白SDS-PAGE结果
•     4.3.7 纯化蛋白ELISA检测结果
•   4.4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 秦领兄

导师: 杜雅楠,包福祥,赵心力

关键词: 寡聚体,双峰驼,单域抗体,噬菌体展示技术

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学,精神病学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: R392;R749.16

DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000195

总页数: 50

文件大小: 3175K

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