普鲁兰酶基因及透明颤菌血红蛋白基因在大肠杆菌BL21中的克隆与共表达

论文摘要

普鲁兰酶属于脱支酶的一种,其可以高效并且专一的的切开支链淀粉中的α-1,6-糖苷键,从而切下支链淀粉的整个支链,形成直连淀粉。这个特点决定了普鲁兰酶蛋白在以淀粉为原料的的工业生产活动中,不管是单独使用还是配合其他淀粉酶共同使用,在降低淀粉质类原料的使用量、降低生产成本、减少废弃尾物,保护环境方便具有很高应用价值。与普鲁兰酶高的应用价值不相匹配的是其较高的酶产品的价格,由于普鲁兰酶是淀粉酶类中唯一一种我国还不能自主生产的酶类,能够应用到实际进行工业化生产的高产普鲁兰酶工程菌一直是相关研究的热点。由于普鲁兰酶分子量较大,所以在大肠杆菌中的表达会受到比较大的限制。透明颤菌血红蛋白的表达受到环境中氧气含量高低的调控,可以协助氧气进入细胞,加快氧气在细胞内的传递,在微生物代谢产物的积累方面有积极的作用。实验室保藏了一株可以产生普鲁兰酶蛋白的菌种,本实验通过蛋白质谱与高通量测序相结合的方法,得到普鲁兰酶蛋白的完整编码序列pulA。通过分子克隆技术,使之成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,透明颤菌血红蛋白编码基因vgb与pulA基因通过共生质粒一起在宿主菌中表达。通过酶活性高低对比,vgb基因在宿主中的表达可以促进宿主代谢产物的表达与积累,pulA的酶活相较于单独表达的重组菌,提高了23倍。该普鲁兰酶编码基因pulA属于Ⅰ型普鲁兰酶,在NCBI中目前并没有完全相同的序列,主要差异体现在第1个碱基到114碱基这段序列,从115个碱基到最后一个碱基,与NCBI检索号为MH411123.1的基因完全一致。该重组酶肽链约由927个氨基酸组成,大小约为93.64KDa;具有较好的耐酸和耐高温性能,pH=4.05.0之间,具有65.78%的相对酶活;pH在5.05.5范围内时,依然具有73.63%的相对活性;相对酶活活性超过90%的温度范围在50℃60℃,相对酶活超过80%的温度范围在45℃50℃之间。以上研究表明,本实验获得的pulA基因编码的蛋白质,具有较好的耐酸与耐高温的性质,和现在已经工业生产的普鲁兰蛋白酶产品相比具有相似的酶学性质,构建的大肠杆菌重组菌成功的表达普鲁兰酶及透明颤菌血红蛋白,普鲁兰酶酶活摇瓶发酵酶活最高可为67.25U/mL,相较于单独表达的普鲁兰酶酶活,pulA与vgb基因共表达时,普鲁兰酶酶活提高了3倍多可达191.47U/mL。所以,重组普鲁兰酶蛋白酶学性质优越,重组菌产酶能力较高,同时在重组菌中表达透明颤菌血红蛋白基因来提高普鲁兰酶酶活,这些为普鲁兰酶工程菌的开发提供了一种新的技术途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 研究背景
•   1.2 淀粉酶的种类
•   1.3 普鲁兰酶简介
•     1.3.1 普鲁兰酶结构及性质
•     1.3.2 普鲁兰酶的应用
•     1.3.3 普鲁兰酶国内外研究现状及进展
•   1.4 透明颤菌血红蛋白简介
•     1.4.1 透明颤菌血红蛋白结构及性质
•     1.4.2 透明颤菌血红蛋白的应用
•   1.5 研究目的及意义
•   1.6 研究内容
• 第2章 材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 试剂盒、工具酶及化学试剂
•     2.1.3 仪器
•     2.1.4 实验试剂及常用溶液配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 基因组de novo测序
•     2.2.2 LC-MS/MS分析
•     2.2.3 核苷酸引物
•     2.2.4 大肠杆菌表达载体的构建
• 第3章 实验结果
•   3.1 蛋白质谱及de novo测序结果
•   3.2 大肠杆菌表达载体的构建
•   3.3 重组普鲁兰酶酶学性质的研究及透明颤菌血红蛋白对普鲁兰酶表达的影响
•     3.3.1 标准曲线
•     3.3.2 酶的最适反应温度
•     3.3.3 酶反应的最适pH
•     3.3.4 不同培养温度下重组大肠杆菌酶活
• 第4章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋健

导师: 余少文

关键词: 普鲁兰酶基因,透明颤菌血红蛋白基因,共表达,酶学性质

来源: 深圳大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 深圳大学

分类号: Q78

总页数: 52

文件大小: 1632K

下载量: 15