猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

【目的】制备猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21（DE3）,用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清（1∶80稀释）37℃孵育1 h,酶标二抗（1∶6 000稀释）37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD450值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材 料
•     1.1.1 载体、细胞、菌株、实验动物和血清
•     1.1.2 主要试剂
•   1.2 N基因的克隆
•   1.3 重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N的构建
•   1.4 重组N蛋白的诱导表达、纯化及其反应原性
•   1.5 多克隆血清的制备
•   1.6 猪δ冠状病毒间接ELISA检测方法的建立
•   1.7 猪δ冠状病毒间接ELISA检测方法特异性、重复性和稳定性检测
•   1.8 猪δ冠状病毒间接ELISA检测方法的临床应用
• 2 结果与分析
•   2.1 猪δ冠状病毒N基因的PCR扩增
•   2.2 猪δ冠状病毒重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N的鉴定
•   2.3 猪δ冠状病毒重组N蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
•   2.4 猪δ冠状病毒重组N蛋白多克隆血清抗体的特异性和效价
•   2.5 猪δ冠状病毒间接ELISA方法的建立
•   2.6 猪δ冠状病毒检测方法的临床应用
• 3 讨 论
• 4 结 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 闫瑞杰,张云飞,刘玲玲,张红垒,王亚宾,胡慧

关键词: 猪冠状病毒,蛋白,原核表达,多克隆抗体,血清学检测

来源: 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2019年10期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学牧医工程学院

基金: 国家重点研发计划项目(2016YFD0500102),国家自然科学基金项目(31772773),河南省科技开放合作项目(15210-6000047)

分类号: S852.651

DOI: 10.13207/j.cnki.jnwafu.2019.10.001

页码: 1-8+17

总页数: 9

文件大小: 996K

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