张华1于虹敏1徐榕青2
（1福建中医药大学药学院福建福州350108）
（2福建省医学科学研究院/福建省医学测试重点实验室福建福州350001）
【摘要】目的建立高效液相色谱法测定雷公藤中雷公藤甲素的含量，比较研究雷公藤根木质部与根皮中雷公藤甲素含量的差异情况。方法色谱柱：InertsilODS-SP（5μm，4.6×250mm）；流动相：乙腈-水（25:75）；流速：1ml/min；检测波长：220nm；柱温：室温；进样量：20μl。结果显示，雷公藤根木质部中雷公藤甲素平均含量为37.1250?g/g，RSD为37.13%，根皮中雷公藤甲素平均含量为93.1454?g/g，RSD%为33.70%。雷公藤根和叶中雷公藤甲素的平均加标回收率分别为95.17-99.18%（RSD为1.74-4.33%）（n=3×3）和102.02-103.33%（RSD为2.19-4.57%）（n=3×3）。雷公藤甲素进样量在4.45μg/ml～178μg/ml范围内，线性关系良好（r=0.9999），本法操作简便、准确，回收率高，可作为雷公藤药材及制剂中雷公藤甲素的含量测定。
【关键词】雷公藤雷公藤甲素HPLC含量测定
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）29-0049-02
雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.的干燥根。雷公藤化学成分繁多，主要为二萜类、三萜类、倍半萜类及生物碱类等，具有抗炎、抗肿瘤等作用。雷公藤甲素是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物，同时也是雷公藤引起毒副作用的主要成分[1-3]。雷公藤甲素相关效价比雷公藤总苷高出100～200倍，既是雷公藤的有效成分同时也是引起不良反应的主要成分。比较雷公藤不同部位中雷公藤甲素的含量差异，对确保雷公藤用药安全具有重要意义。关于雷公藤药材不同部位不同产地雷公藤甲素含量测定已有文献报道[4-6]，但未有雷公藤根木质部与根皮中雷公藤甲素含量的比较研究。本次试验采用高效液相色谱法建立雷公藤根木质部、根皮的HPLC含量测定方法，分析比较雷公藤这2个部位化学成分种类及含量上的差异，为有效控制雷公藤药材质量、合理利用雷公藤资源提供实验依据。
1仪器与试药
LC-20A半制备高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AL204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，5L/H50w型超纯水机(重庆艾科浦有限公司)，TYSP-100高速多功能粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司)等。
雷公藤甲素对照品(批号:1566-200201)购自中国食品药品检定研究院。雷公藤内酯醇对照品购自中国药品生物制品鉴定所，批号1566-200201；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。雷公藤样品采自福建省闽清县下祝乡，除去表层泥沙后清洗干净，沥干，60℃条件下干燥至恒重。将整株植物分成根木质部、根皮两个部分，分别粉碎成细粉（过4号筛），放入干燥器内，备用。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：InertsilODS-SP（5μm，4.6×250mm）；流动相：乙腈-水（25:75）；流速：1ml/min；紫外检测波长：220nm；柱温：室温；进样量：20μl。
2.2对照品溶液制备
精密称取雷公藤甲素对照品8.9mg，置10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1ml含0.89mg的溶液，作为雷公藤甲素对照品储备液。
2.3供试品溶液制备
取雷公藤根木质部、根皮粉末各1g分别加入25ml95%乙醇，回流提取4h，抽滤，滤渣用10ml95%乙醇冲洗，合并滤液，浓缩至2ml左右，用乙酸乙酯-水（1:1）20ml萃取2次，合并乙酸乙酯层萃取液浓缩至1ml，过中性氧化铝柱（2g，200～300目），用乙酸乙酯-石油醚（60℃～90℃）（4:1）20ml洗脱，收集洗脱液，挥干溶剂，乙腈溶解，定容至1ml，即得。进样前过0.45μm的微孔滤膜。对照品及供试品色谱图见图1.
图4-1雷公藤甲素对照品、雷公藤根木质部及根皮样品液相色谱图
a雷公藤甲素对照品b雷公藤根木质部c雷公藤根皮
2.4方法学考察
2.4.1线性关系考察
精密吸取雷公藤甲素对照品储备液0.05ml、0.1ml、0.4ml、0.6ml、2ml于10ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述不同质量浓度的对照品溶液，按“2.1项”色谱条件下进样测定。以峰面积对质量浓度进行线性回归，得回归方程和r：y=41787x-7535.5，r=0.9993。结果显示雷公藤甲素在4.45μg/ml～178μg/ml范围内线性关系良好。
2.4.2精密度实验
精密吸取雷公藤甲素对照品溶液，按“2.1项”色谱条件，连续进样6次，考察精密度。结果雷公藤甲素的峰面积RSD为0.06%，符合要求。
2.4.3稳定性实验
精密吸取同一供试品溶液，按“2.1项”色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定峰面积。计算雷公藤甲素的峰面积RSD值为0.27%，实验结果显示供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.4.4重复性实验
取同一雷公藤根木质部样品6份，每份约1g，精密称定，按“2.3项”方法制备，按“2.1项”色谱条件，计算得雷公藤甲素峰面积的RSD值为1.5%，该方法的重复性良好。
2.4.5加样回收率实验
称取雷公藤根木质部粉末6份，每份0.5g，精密称定，精密加入对照品溶液适量，按“2.3项”方法制备，按“2.1项”色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。
表1加样回收率结果（n=6）
737.5642114.0398
831.3971106.4123
956.3290124.0745
1019.962569.6519
4讨论
4.1实验比较乙醇回流、超声提取、甲醇索氏提取以及乙酸乙酯、大孔树脂处理等方法对雷公藤甲素含量的影响，结果显示乙醇回流提取的雷公藤甲素含量最高且杂质较少。此外，选用乙酸乙酯萃取，浓缩后过氧化铝柱进行样品前处理后，色谱图中显示峰形较好，成分较多，且分离度较好，提取效率高。
4.2实验考察不同流动相（甲醇-水、乙腈-水）对雷公藤甲素含量测定影响，且选用不同流动相比例，并采用等度和梯度的洗脱方式。结果显示，选择乙腈（A）-水（B）为流动相，等度洗脱（75(A)-25(B)），分离度较好。
4.3实验通过对10批雷公藤根木质部、根皮和茎三个部位的雷公藤甲素含量进行测定，雷公藤根木质部、根皮中雷公藤甲素平均含量分别为37.1250?g/g、93.1454?g/g，不同部位雷公藤甲素含量差异显著。雷公藤根皮中所含雷公藤甲素的含量最高，约为根木质部的2.5倍，雷公藤甲素既是有效成分，有较高的药理活性，但又具有毒性，故雷公藤饮片炮制时多采用采用去皮减毒工艺。
试验结果表明，本法操作简便、准确，回收率高，可作为雷公藤药材及制剂中雷公藤甲素的含量测定。
参考文献
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福建省自然科学基金项目(2010J01024)