产色素粘质沙雷氏菌的分离鉴定及含灵菌红素合成酶的载体构建

论文摘要

粘质沙雷氏菌生长过程中会产生一种次级代谢产物灵菌红素。灵菌红素具有多种的生物活性,能够抗疟疾、抗肿瘤、免疫抑制等。野生型粘质沙雷氏菌产生的灵菌红素产量少,不能满足工业化生产的需求。单优化培养基也不能使灵菌红素的产量有很大的提高。随着生物技术的发展,通过基因工程研究粘质沙雷氏菌的产灵菌红素基因,提高灵菌红素的产量是一条可行的途径。论文通过平板划线法从湖水中分离纯化得到的一株产色素菌株。用引物27F和1492R对菌株进行16S rDNA扩增。测序结果与NCBI基因库中比对分析,确定菌株的属种。然后,采用甲醇提取菌体中色素,将粗提取物进行柱层析分离、纯化,获得较纯的红色色素。采用可见光光度计,傅里叶红外光谱（FTIR）,高效液相色谱与质谱联用（LC-MS）分析鉴定红色色素。论文还研究了灵菌红素基因克隆及载体的构建。根据NCBI查找到的菌株同源序列,分别设计了含酶切位点的灵菌红素合成酶引物和非编码序列的引物。对灵菌红素合成关键酶基因pigF和pigC进行扩增,并与pBM20-T载体连接,转化筛选获得克隆菌株。扩增灵菌红素基因簇前端的非编码序列,通过重叠PCR（Overlap PCR）将非编码序列同克隆基因拼接得到重组基因。将重组基因连接pBM16A-T后,转入粘质沙雷氏菌中,通过SDS-PAGE分析重组基因表达情况。论文得到以下结果:1.经过多次划线分离,获得一株产红色色素细菌。16S rDNA测序结果显示菌株与粘质沙雷氏菌具有98%的相似度。使用酸性甲醇提取得到色素粗提取物,经柱层析分离得到纯化的红色色素,确定最佳展开剂为石油醚:乙酸乙酯=4:1。薄层色谱对红色色素分析,其Rf=0.35。使用可见光光度计扫描400-700 nm波长,图谱显示色素的最大吸收峰在535 nm。使用FTIR分析红色色素,结果表明色素的主要吸收波数为3436 cm-1、2860 cm-1、2924 cm-1和1628 cm-1。使用LC-MS分析,图谱显示主要离子峰为324.5 m/z和325.5 m/z。分析结果与已知灵菌红素结构特征对比,认定红色色素为灵菌红素。据此,获得了一株产灵菌红素的粘质沙雷氏菌。2.用设计的引物分别扩增出合成酶pigF和pigC基因为1200 bp和2700 bp。将pigF和pigC基因扩增产物与pBM20-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,挑取连接成功的克隆子测序。测序结果与NCBI比对,结果显示pigF和pigC基因与沙雷氏菌FS14的同源性最高。用引物扩增出非编码区的coa-1基因为600 bp。经Overlap PCR,将coa-1基因部分序列与pigC和pigF基因拼接,重组为coa-pic和coa-pif基因。然后分别与pBM16A-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,挑取连接成功的克隆子测序。测序结果与NCBI比对,结果显示coa-1与pigC、pigF序列重组成功,构建出pBM16A-coa-pif和pBM16A-coa-pic质粒。3.构建出的质粒转入粘质沙雷氏菌中筛选出重组子S.m-pif和S.m-pic。用SDS-PAGE分析重组子的蛋白表达,电泳结果显示重组子都正确表达出蛋白质条带。通过比对细菌生长中色素吸光度变化,发现S.m-pif菌株灵菌红素产量相比野生菌株提高了6.8%而S.m-pic菌株相比野生菌株提高了17.1%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 粘质沙雷氏菌
•   1.3 次级代谢产物灵菌红素
•     1.3.1 灵菌红素的结构和性质
•     1.3.2 灵菌红素研究进展
•   1.4 研究内容
•   1.5 研究目的及意义
•   1.6 技术路线
• 第2章 粘质沙雷氏菌分离鉴定与灵菌红素提取分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验药品
•     2.1.2 实验仪器
•     2.1.3 培养基配方
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 菌株分离鉴定
•     2.2.2 色素粗提取物及纯化
•     2.2.3 色素分析
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 菌株的分离与鉴定
•     2.3.2 16S rDNA序列分析
•     2.3.3 细菌色素分析
•   2.4 小结与讨论
• 第3章 Pig F和 PigC基因克隆及表达载体构建
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验菌株和质粒
•     3.1.2 实验仪器
•     3.1.3 实验药品
•     3.1.4 引物序列
•     3.1.5 培养基配方
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 试剂盒使用方法
•     3.2.2 粘质沙雷氏菌基因的克隆
•     3.2.3 载体构建
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 pigF基因与pigC基因克隆结果
•     3.3.2 表达载体构建
•   3.4 小结与讨论
• 第4章 重组沙雷氏菌株表达
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验菌株和质粒
•     4.1.2 实验仪器
•     4.1.3 实验药品
•     4.1.4 试剂配方
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 感受态制备
•     4.2.2 细菌电转化
•     4.2.3 SDS-PAGE分析
•     4.2.4 色素产量分析
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 S.m-pif菌株和S.m-pic菌株的筛选
•     4.3.2 S.m-pif菌株和S.m-pic菌株的生长曲线
•     4.3.3 S.m-pif和 S.m-pic菌株表达
•     4.3.4 S.m-pif菌株和S.m-pic菌株的灵菌红素吸光度曲线
•   4.4 小结与讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间取得学术成果
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张叶飞

导师: 王以明,刘科

关键词: 粘质沙雷氏菌,灵菌红素,载体构建,蛋白表达,灵菌红素合成酶

来源: 成都理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 成都理工大学

分类号: Q78;Q93

DOI: 10.26986/d.cnki.gcdlc.2019.000450

总页数: 69

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