β-葡萄糖苷酶的异源表达以及CRISPR-Cas9系统在草酸青霉中的应用

论文摘要

随着石化燃料消耗速率的不断增加,环境和资源危机日益加剧。因此,迫切需求生物乙醇、生物柴油和生物氢等替代型能源。植物来源的生物质是地球上最为丰富的可再生资源。利用植物生物质原料向生物燃料和化学品的高效转化可以有效地缓解能源和环境危机。丝状真菌可高效地表达木质纤维素酶,降解植物生物质,对自然界的碳循环发挥着重要的作用。目前,在丝状真菌中,木质纤维素酶系的低水解效率导致的酶使用高成本是木质纤维素生物质经济转化中的主要瓶颈。丝状真菌木质纤维素降解酶系由多种水解酶组成,主要包括外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中重要的组分之一,其主要作用是将纤维寡糖或纤维二糖水解为葡萄糖,对纤维素的降解有重要作用,但其含量占整个酶系的比重相对较低,成为限制纤维素酶高效转化生物质资源的重要因素。因此,以木质纤维素酶高产菌株草酸青霉（Penicillium oxalicum）为靶点,重构纤维素酶系的表达调控,构建产β-葡萄糖苷酶高性能菌株,对增强纤维素酶在生物质资源的高效转化应用方面具有重要意义。本论文主要研究成果如下:1.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在草酸青霉中的异源表达前期研究中,构建了一株纤维素酶高产菌株草酸青霉PT3-1,其纤维素酶表达水平相比出发菌株有大幅度提高,但β-葡萄糖苷酶的表达量相对较低。因此,设想在草酸青霉中异源表达其它丝状真菌来源的β-葡萄糖苷酶的方式来解决这一问题。已有研究结果发现,来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有较高的比活力,且葡萄糖耐受性较高,这将利于提高对纤维素的降解效率。本实验中,我们构建了三种β-葡萄糖苷酶（来源于黑曲霉）的过表达盒,分别以草酸青霉的bgl2启动子、cbh1启动子和PDE02864基因启动子作为黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因异源表达盒的启动子。将以上三种表达盒在高产纤维素酶菌株PT3-1中进行表达,得到了一株高产β-葡萄糖苷酶菌株C3-1。C3-1突变株在发酵120 h后β-葡萄糖苷酶活力达到172.6 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了244倍和156倍;滤纸酶活为3.2 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了7倍和1.5倍。得到一株高滤纸酶活菌株CD46-1,在发酵144 h的滤纸酶活最高为3.43 U/mL,分别是野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1的7.5倍和1.6倍,其胞外蛋白也明显增多。2.优化β-rec/six重组系统构建高产β-葡萄糖苷酶菌株在前期研究结果中,已经在草酸青霉中建立了β-rec/six位点的遗传筛选标记循环利用系统。但利用该系统去除筛选标记后,β-丝氨酸重组酶基因仍留存在染色体上,这可能会对染色体上其他位点产生不利影响。通过查阅文献,对β-rec/six重组系统进行了优化,构建了在转化子基因组中无Rec重组酶痕迹的重组系统。在利用该系统去除筛选标记的同时,β-丝氨酸重组酶基因也被切除,避免了因β-丝氨酸重组酶基因的持续表达产生的不利影响。该系统可用于后续β-葡萄糖苷酶高产菌株的构建。3.CRISPR-Cas9系统在草酸青霉中的应用CRISPR-Cas9系统是一种强大的基因编辑方法,目前已广泛应用于丝状真菌中。然而,在草酸青霉中尚未报道关于该基因编辑系统的应用。本章研究中,在草酸青霉中尝试表达携带Cas9蛋白基因的质粒,并筛选了多种用于体内转录sgRNA的RNA聚合酶III型（Pol III）的启动子,构建了多种不同的sgRNA表达盒,初步探究了CRISPR-Cas9基因编辑系统草酸青霉中的应用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 丝状真菌木质纤维素降解酶系
•     1.1.1 丝状真菌木质纤维素酶系的组成
•     1.1.2 丝状真菌半纤维素酶系的组成
•     1.1.3 丝状真菌木质纤维素酶系的协同作用与合成调控
•     1.1.4 丝状真菌木质纤维素酶的研究进展
•   1.2 β-葡萄糖苷酶
•     1.2.1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质
•     1.2.2 β-葡萄糖苷酶的催化机理
•     1.2.3 β-葡萄糖苷酶在工业中的应用
•     1.2.4 β-葡萄糖苷酶的研究进展
•   1.3 Red/ET重组技术
•     1.3.1 Red/ET系统简介
•     1.3.2 Red/ET重组技术的应用
•   1.4 β-rec/six自删除系统
•     1.4.1 β-rec/six自删除系统的原理
•     1.4.2 β-rec/six自删除系统在丝状真菌中的研究现状
•   1.5 CRISPR-Cas9 基因编辑技术
•     1.5.1 CRISPR-Cas9 系统的组成及作用原理
•     1.5.2 CRISPR-Cas9 技术的基因编辑机制
•     1.5.3 CRISPR-Cas9 技术的脱靶效应
•     1.5.4 CRISPR-Cas9 技术的操作步骤
•     1.5.5 CRISPR-Cas9 技术在丝状真菌中的应用
•   1.6 本论文的立题依据和研究意义
• 第2章 黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在草酸青霉中的异源表达
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 常用溶液配制
•     2.1.4 主要生化试剂和实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 构建bgl1 过表达盒
•     2.2.2 利用Red/ET重组技术构建质粒
•     2.2.3 原生质体的制备
•     2.2.4 原生质体转化
•     2.2.5 转化子的分离纯化
•     2.2.6 基因组DNA的小量提取
•     2.2.7 转化子的PCR验证
•     2.2.8 胞外酶活力测定
•     2.2.9 过表达菌株表型分析
•     2.2.10 胞外蛋白浓度测定和蛋白电泳分析
•     2.2.11 Southern杂交
•     2.2.12 荧光定量PCR
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 bgl1 过表达盒的构建
•     2.3.2 过表达bgl1 转化子的分离与验证
•     2.3.3 过表达转化子的酶活测定
•     2.3.4 过表达转化子的表型分析
•     2.3.5 过表达转化子胞外蛋白浓度测定和蛋白电泳分析
•     2.3.6 Southern杂交分析
•     2.3.7 荧光定量PCR分析
•   2.4 本章小结
• 第3章 优化β-rec/six重组系统构建高产β-葡萄糖苷酶菌株
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 培养基
•     3.1.3 主要溶液配制
•     3.1.4 主要生化试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 基于β-rec/six重组技术构建bgl1 过表达盒
•     3.2.2 bgl1-β-rec/six过表达盒在草酸青霉中的表达
•     3.2.3 bgl1-β-rec/six过表达菌株筛选标记的去除及反选
•     3.2.4 过表达转化子的酶活测定
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 基于β-rec/six重组技术bgl1 过表达盒的构建
•     3.3.2 bgl1-β-rec/six转化子的分离与验证
•     3.3.3 去除筛选标记菌株的分离与验证
•     3.3.4 剪切前后菌株的酶活测定
•   3.4 本章小结
• 第4章 CRISPR-Cas9 系统在草酸青霉中的应用
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 培养基
•     4.1.3 主要溶液配制
•     4.1.4 主要生化试剂与实验仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 携带Cas9 蛋白基因的质粒说明
•     4.2.2 Cas9 蛋白在草酸青霉中的表达
•     4.2.3 构建sgRNA表达盒
•     4.2.4 Cas9 蛋白与sgRNA的共表达
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 质粒的线性化
•     4.3.2 sgRNA表达盒的构建
•     4.3.3 Cas9 蛋白基因转化子的分离与验证
•     4.3.4 质粒PFC332 转化子打靶结果验证
•     4.3.5 质粒pDHtsk–PE转化子的荧光检测
•   4.4 本章小结
• 第5章 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间主要科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王亚南

导师: 鲍晓明,李忠海

关键词: 草酸青霉,葡萄糖苷酶,重组

来源: 齐鲁工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 齐鲁工业大学

分类号: Q78

总页数: 77

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