基于氨基酸代谢的原位生物正交标记动态示踪肠道病毒EV71侵染的研究

基于氨基酸代谢的原位生物正交标记动态示踪肠道病毒EV71侵染的研究

论文摘要

肠道病毒EV71(Enterovirus 71,EV71)作为引发手足口病(Hand Foot Mouth Disease,HFMD)的主要病原体,可导致脑炎、脑膜炎、急性弛缓性麻痹、心肺功能衰竭甚至死亡。然而,目前对肠道病毒EV71感染机制仍不够清晰,国家和社会对相关疾病的防控依然面临巨大挑战。示踪病毒感染途径是研究病毒感染机制不可或缺的手段,而病毒的成功标记是实现病毒示踪的关键。常规的基因工程、直接化学偶联或病毒自组装等方法存在操作繁杂,标记效率低,普适性差和影响病毒活性等缺陷,难以推广应用。近年来,基于代谢工程的生物正交标记技术由于具有高效、特异、无损、稳定的优势,正日益成为标记活体生物系统的重要手段。该策略通过天然代谢途径在靶标物中引入特定的化学报告基团,然后通过生物正交反应与携带配对基团的标记物进行共价连接,从而实现对靶标物的特异标记。鉴于病毒衣壳蛋白合成依赖于宿主细胞,因此利用细胞氨基酸代谢可有效实现病毒衣壳修饰。为实现肠道病毒EV71高效无损的标记与示踪,本研究提出一种新型的基于氨基酸代谢的病毒原位生物正交标记技术,并利用该技术对肠道病毒EV71侵染机制进行深入探究。1.基于氨基酸代谢修饰的肠道病毒EV71生物正交标记技术的建立。利用宿主细胞氨基酸代谢将甲硫氨酸叠氮衍生物(L-Azidohomoalanine,Aha)嵌入子代病毒衣壳蛋白中,成功制备叠氮修饰的肠道病毒EV71(N3-EV71)。N3-EV71通过生物正交反应与携带二苯基环辛炔(DBCO)的荧光探针形成稳定连接,从而成功实现病毒的原位标记。结果表明,DBCO-探针能够高效、特异地捕获N3-EV71病毒粒子实现病毒标记,并且叠氮基团的代谢修饰和荧光探针的原位标记能有效保护病毒侵染活性,为后续病毒的动态示踪提供了可靠的技术手段。2.生物正交标记动态示踪研究肠道病毒EV71的侵染机制。我们运用SYTO染料与原位生物正交技术分别对病毒核酸与衣壳进行无损标记,实现病毒双重标记与动态示踪。结果显示,肠道病毒EV71与细胞表面清道夫受体结合后经网格蛋白介导的内吞入胞,并在晚期内涵体酸性环境中完成病毒核酸的快速释放,阐明了EV71病毒的侵染过程与脱衣壳机制。本研究提出并建立了一种新型的基于氨基酸代谢的原位生物正交标记技术,并利用该技术对肠道病毒EV71进行无损标记与动态示踪,成功阐明其侵染机制,为相关抗病毒药物的研制提供新的理论依据。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第1章 引言
  •   1.1手足口病和肠道病毒EV71
  •   1.2 病毒标记示踪的研究进展
  •     1.2.1 基因工程标记技术
  •     1.2.2 直接化学偶联或物理嵌合标记技术
  •     1.2.3 病毒自组装标记技术
  •     1.2.4 生物正交化学在标记领域内的应用
  •   1.3 本文立足点和研究内容
  • 第2章 氨基酸代谢修饰肠道病毒EV71
  •   2.1 前言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 材料与试剂
  •     2.2.2 培养基及相关溶液配制
  •     2.2.3 细胞培养
  •     2.2.4 甲硫氨酸叠氮衍生物(Aha)的生物安全性评价
  • 3-EV71)的制备和纯化'>    2.2.5 叠氮化肠道病毒EV71(N3-EV71)的制备和纯化
  • 3-EV71)的鉴定'>    2.2.6 叠氮化肠道病毒EV71(N3-EV71)的鉴定
  • 3-EV71)的毒力鉴定'>    2.2.7 叠氮化肠道病毒EV71(N3-EV71)的毒力鉴定
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 甲硫氨酸叠衍生物(Aha)的生物安全性评价
  • 3-EV71)的鉴定'>    2.3.2 叠氮化肠道病毒EV71(N3-EV71)的鉴定
  • 3-EV71)的毒力鉴定'>    2.3.3 叠氮化肠道病毒EV71(N3-EV71)的毒力鉴定
  •   2.4 本章小结
  • 第3章 建立病毒原位生物正交标记体系
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料和方法
  •     3.2.1 材料与试剂
  • 3-EV71)'>    3.2.2 原位生物正交标记叠氮化肠道病毒EV71(N3-EV71)
  •     3.2.3 动态示踪原位生物正交标记过程
  •     3.2.4 分析原位生物正交标记对病毒活性的影响
  •   3.3 结果与讨论
  • 3-EV71)'>    3.3.1 原位生物正交标记叠氮化肠道病毒EV71(N3-EV71)
  •     3.3.2 动态示踪原位生物正交标记过程
  •     3.3.3 分析原位生物正交标记对病毒活性的影响
  •   3.4 本章小结
  • 第4章 动态示踪肠道病毒EV71侵染宿主细胞的过程
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料和方法
  •     4.2.1 材料与试剂
  •     4.2.2 原位生物正交标记示踪肠道病毒EV71侵染细胞初期阶段
  •     4.2.3 原位生物正交标记示踪肠道病毒EV71细胞内运输
  •     4.2.4 动态示踪肠道病毒EV71脱衣壳过程
  •     4.2.5 动态示踪pH依赖的肠道病毒EV71脱衣壳机制研究
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 原位生物正交标记示踪肠道病毒EV71侵染细胞初期阶段
  •     4.3.2 原位生物正交标记示踪肠道病毒EV71细胞内运输
  •     4.3.3 动态示踪肠道病毒EV71脱衣壳过程
  •     4.3.4 动态示踪pH依赖的肠道病毒EV71脱衣壳机制研究
  •   4.4 本章小结
  • 第5章 糖类和氨基酸代谢对肠道病毒EV71修饰效率的比较
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料和方法
  •     5.2.1 材料与试剂
  •     5.2.2 糖类叠氮衍生物的生物安全性评价
  •     5.2.3 糖类叠氮衍生物代谢修饰病毒粒子的制备
  •     5.2.4 原位生物正交标记分析叠氮在病毒粒子表面修饰效果
  •     5.2.5 蛋白质印迹法分析叠氮修饰的病毒衣壳蛋白
  •   5.3 结果与讨论
  •     5.3.1 糖类叠氮衍生物的生物安全性评价
  •     5.3.2 原位生物正交标记分析叠氮在病毒粒子表面修饰效果
  •     5.3.3 蛋白质印迹法分析叠氮修饰的病毒衣壳蛋白
  •   5.4 本章小结
  • 第6章 结论与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王芳芳

    导师: 蔡林涛,黄逸凡

    关键词: 氨基酸代谢,原位生物正交标记,病毒侵染,核酸释放

    来源: 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)

    分类号: R373.25

    总页数: 64

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