北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）天冬氨酸激酶突变体酶学性质表征及工程菌构建

论文摘要

天冬氨酸激酶（AK）是催化天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的关键酶,其活性受Lys和Thr协同反馈抑制作用,调控整个代谢途径的碳流量,从而限制产物的过量积累,因此变构抑制的解除是设计和优化代谢途径的巨大挑战。本研究以北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）天冬氨酸激酶（CpAK）为研究对象,通过定点饱和突变和高通量筛选技术成功获得酶学性质显著改善的7种AK突变体。对野生型（WT）和突变体AK分别进行酶促动力学和酶学性质研究,利用分子动力学模拟进一步探讨了酶催化活性显著提高的作用机制,并利用电转化法将高酶活力的突变体AK转入到北京棒杆菌原菌中,成功构建了2株工程菌。结果如下:1.通过同源比对和结构网格分析发现CpAK M372、T379和E400位点是抑制剂Lys结合口袋中的关键残基且高度保守,因此本研究对以上3个位点进行分子改造,试图削弱Lys结合口袋残基与抑制剂Lys的结合,从而解除Lys对AK的反馈抑制作用。2.经突变PCR扩增、转化、高通量筛选等步骤成功获得7种AK酶学性质显著改善的突变体,分别为M372I、T379W、T379S、E400A、M372I/E400A、M372I/T379S和M372I/T379W。通过SDS-PAGE和Western blot验证表明突变体AK在大肠杆菌中实现了高效表达。3.WT AK和突变体AK分别进行酶促动力学及酶学特性研究,结果表明:与WT AK的最大反应速率Vmax 2.78 U/mg·min-1相比,突变体的Vmax均提高,其中双突变体M372I/T379S和M372I/T379W分别提高了15.60和17.68倍;突变体M372I/E400A与M372I/T379W表现出良好的耐热性,均由28℃升至35℃;除突变体M372I/T379W AK外,其余突变体AK最适pH均有小幅度升高,其中M372I/E400A和M372I/T379W耐受pH范围更广,分别在7.5-9.5和6.5-9.0 pH范围内保持相对酶活力50%以上;突变体AK与WT AK相比更稳定,尤其是突变体M372I/E400A、M372I/T379S和M372I/T379W表现为更好的稳定性,较WT AK半衰期分别延长了1.3、2.3、1.2 h。4.WT AK酶活力受抑制剂Lys和Thr的反馈抑制作用,当浓度为5和10 mmol/L时,受Lys与Thr二者协同抑制最显著。与WT AK相比,在0.2-10 mmol/L浓度范围内,突变体T379S、M372I/T379S、T379W和M372I/T379W均有不同程度解除Lys的反馈抑制作用,特别是抑制剂Lys单独存在时,随着Lys浓度增大,AK激活作用越显著,呈现出剂量依赖关系。经微量热泳动分析结果显示M372I/T379W AK不仅削弱了抑制剂Lys的反馈抑制作用,还增强了其与底物Asp的结合强度。5.分子动力学模拟结果表明,M372I和T379W突变后引起了整个蛋白质的回转半径Rg和溶剂可及表面积SASA显著增大,以及ATP/Asp结合口袋附近残基的结构重排。M372I/T379W AK残基簇Leu288-Gly363和Lys364-Ala418之间的角度从107.9°降至93.1°,使得AK由闭合状态转为开放状态。M372I/T379W AK与ATP及Asp之间的氢键占有率增多,并且Asp结合口袋入口门Arg169-Ala60距离由9.6?增至15.1?,使得空间位阻消失,促进了AK与底物Asp结合,从而提高了AK催化效率。6.通过电转化法成功构建了M372I/T379S和M372I/T379W工程菌株,并进行发酵分析。工程菌M372I/T379S和M372I/T379W发酵液中总氨基酸含量高达53.64 g/L和57.88g/L,较北京棒杆菌原菌分别增长了4.92 g/L和9.16 g/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 选题来源
•   1.2 天冬氨酸激酶概述
•     1.2.1 天冬氨酸族氨基酸合成及代谢途径
•     1.2.2 天冬氨酸激酶结构分类及调控机制
•     1.2.3 天冬氨酸激酶三维结构
•   1.3 天冬氨酸激酶的国内外研究进展
•     1.3.1 天冬氨酸激酶的国外研究
•     1.3.2 天冬氨酸激酶的国内研究
•   1.4 技术手段
•   1.5 研究内容
•   1.6 研究目的和创新点
•   1.7 技术路线
• 2 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 菌种
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 培养基和试剂
•     2.1.4 仪器和设备
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 质粒提取
•     2.2.2 定点饱和突变
•     2.2.3 转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态
•     2.2.4 高通量筛选
•     2.2.5 蛋白分离纯化及电泳验证
•     2.2.6 酶学特性
•     2.2.7 分子动力学模拟
•     2.2.8 工程菌构建
• 3 结果与分析
•   3.1 AK突变位点确定
•   3.2 PCR核酸验证结果
•   3.3 SDS-PAGE和 Western blot验证结果
•   3.4 酶促动力学研究
•   3.5 酶学性质表征
•     3.5.1 最适温度
•     3.5.2 最适pH
•     3.5.3 稳定性
•     3.5.4 底物抑制剂对酶活力的影响
•     3.5.5 微量热泳动（MST）分析
•   3.6 分子动力学（MD）模拟
•     3.6.1 复杂系统的结构稳定性
•     3.6.2 M372I/T379W突变引起的构象变化
•   3.7 工程菌的构建
•     3.7.1 穿梭表达载体构建
•     3.7.2 发酵分析
• 4 讨论
•   4.1 突变体AK削弱底物抑制剂抑制作用
•   4.2 M372I/T379WAK催化活性显著提高的作用机制讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高云娜

导师: 闵伟红

关键词: 天冬氨酸激酶,反馈抑制,酶学特性,分子动力学模拟

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 吉林农业大学

基金: 国家自然科学基金(31771957)

分类号: Q55

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000239

总页数: 55

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