携带NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其评价

论文摘要

构建稳定表达NMU2R shRNA的重组腺相关病毒载体,制备并纯化靶向性沉默NMU2R表达的高滴度重组腺相关病毒。首先设计合成NMU2R shRNA,退火形成双链与p AAV-ZsGreen-shRNA质粒Bam H I和Hind III双酶切产物相连接构建形成质粒p AAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA,经双酶切和测序鉴定证实,重组质粒克隆正确,将重组质粒转染到AAV-293包装细胞中包装成腺相关病毒载体,成功制备重组腺相关病毒r AAV5-Zs Green-r NMU2R shRNA,经测定纯化所得r AAV5病毒滴度为1×1012vg/m L。最后将r AAV5-Zs Green-r NMU2R shRNA感染大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12,检测NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒载体p AAV-ZsGreen-shRNA作对照,Real-time PCR及Western Blot方法测得NMU2R mRNA及蛋白表达水平与对照组相比显著下降。综上,成功构建了高滴度携带NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体r AAV5-Zs Green-r NMU2R shRNA。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 主要试剂及细胞株
•   1.2 NMU2R shRNA的设计和构建
•   1.3 重组质粒pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA的构建与鉴定
•   1.4 r AAV5-Zs Green-r NMU2R shRNA病毒包装
•   1.5 r AAV5-Zs Green-r NMU2R shRNA病毒滴度的测定
•   1.6 腺相关病毒感染PC12细胞以及靶基因NMU2R沉默效率的验证
•   1.7 统计学方法
• 2 结果与分析
•   2.1 pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA质粒酶切鉴定
•   2.2 r AAV5-Zs Green-r NMU2R shRNA病毒包装纯化及滴度检测
•   2.3 腺相关病毒感染PC12细胞以及靶基因NMU2R的沉默效率评价
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 郭莉霞,殷钟意,郑旭煦

关键词: 受体,干扰,重组腺相关病毒

来源: 生物学杂志 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 重庆工商大学环境与资源学院,天然药物研究重庆高校市级重点实验室

基金: 国家自然科学基金(81603173),重庆市教委科学技术研究项目(KJ1600607),重庆高校市级重点实验室开放课题(1456032)

分类号: Q78

页码: 14-17

总页数: 4

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