一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒论文和设计-赵志军

全文摘要

本申请公开了一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，不仅包括试剂盒本体，还包括位于试剂盒本体的固定板、引物板及96孔PCR反应板；固定板上设置有用于固定引物板的第一凹槽和用于放置各离心管的第二凹槽，第二凹槽的个数与离心管的个数一一对应；引物板上设置有用于放置装有多种目标引物的多个试管的第三凹槽，第三凹槽的个数与试管的个数一一对应，一个试管装有一种目标引物，试管口处安装有螺旋密封的盖子。该试剂盒中包含有用于盛放多种目标引物的多个试管的引物板，实际检测多少种引物，就在引物板上设置多少个第三凹槽，放置多少个试管，可实现对多种感染源的诊断，确保临床精准诊断感染病原体类型和调整用药策略，降低患者死亡率。

主设计要求

1.一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，包括试剂盒本体，其特征在于，还包括：位于所述试剂盒本体的固定板、引物板以及96孔PCR反应板；所述固定板上设置有用于固定所述引物板的第一凹槽和用于放置各离心管的第二凹槽，所述第二凹槽的个数与所述离心管的个数一一对应；所述引物板上设置有用于放置装有多种目标引物的多个试管的第三凹槽，所述第三凹槽的个数与所述试管的个数一一对应，一个所述试管装有一种所述目标引物，所述试管出口处安装有螺旋密封的盖子。

设计方案

1.一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，包括试剂盒本体，其特征在于，还包括：

位于所述试剂盒本体的固定板、引物板以及96孔PCR反应板；

所述固定板上设置有用于固定所述引物板的第一凹槽和用于放置各离心管的第二凹槽，所述第二凹槽的个数与所述离心管的个数一一对应；

所述引物板上设置有用于放置装有多种目标引物的多个试管的第三凹槽，所述第三凹槽的个数与所述试管的个数一一对应，一个所述试管装有一种所述目标引物，所述试管出口处安装有螺旋密封的盖子。

2.根据权利要求1所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，所述螺旋密封的盖子上还设置有用于密封的密封圈。

3.根据权利要求1所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，各所述第二凹槽位于所述固定板的同一侧。

4.根据权利要求3所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，各所述第二凹槽均匀分布于所述固定板的同一侧。

5.根据权利要求1所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，所述第二凹槽和所述第三凹槽的横截面均为圆形。

6.根据权利要求1所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，所述引物板的横截面为长方形；

对应地，所述第一凹槽的横截面为长方形。

7.根据权利要求6所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，还包括：

安装于所述引物板，位于所述第三凹槽一侧与所述引物板的边沿相扣的盖子。

8.根据权利要求1所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，所述固定板和所述96孔反应板平铺于所述试剂盒本体的底部位置处。

9.根据权利要求1所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，各所述离心管和各所述试管上均还包括刻蚀层。

10.根据权利要求1至9任意一项所述的用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒本体具体为正方体。

设计说明书

技术领域

本申请涉及医疗领域，尤其涉及一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒。

背景技术

目前，中枢神经感染、脑炎、脑膜炎大部分都是由各种病原体引起的，因此，对各种病原体的快速检测显得尤为重要。不然，就会引起较高病死率、住院费用上升和床位周转天数增加等卫生经济学问题。

现今，主要通过诊断试剂盒实现对脑脊液感染源的检测，但是，传统的检测方式只能判断出患者是否感染一种特定病原体，而无法确定患者是否还感染有其它种类的病原体，可检测的感染源种类少，诊断准确性较低，进而使诊断者不能在临床上准确用药，会错过患者的最佳治疗时间，更有甚者会导致患者出现意外情况。

由此可见，如何增加感染源的检测种类、提高感染源的检测准确性以使临床精准诊断感染病原体类型和调整用药策略，降低患者死亡率的问题是本领域技术人员亟待解决的问题。

实用新型内容

本申请提供了一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，解决了现有技术中如何增加感染源的检测种类、提高感染源的检测准确性以使临床精准诊断感染病原体类型和调整用药策略，降低患者死亡率的问题。

为解决上述技术问题，本申请提供了一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，包括试剂盒本体，还包括：

位于所述试剂盒本体的固定板、引物板以及96孔PCR反应板；

所述固定板上设置有用于固定所述引物板的第一凹槽和用于放置各离心管的第二凹槽，所述第二凹槽的个数与所述离心管的个数一一对应；

优选地，所述螺旋密封的盖子上还设置有用于密封的密封圈。

优选地，各所述第二凹槽位于所述固定板的同一侧。

优选地，各所述第二凹槽均匀分布于所述固定板的同一侧。

优选地，所述第二凹槽和所述第三凹槽的横截面均为圆形。

优选地，所述引物板的横截面为长方形；

对应地，所述第一凹槽的横截面为长方形。

优选地，还包括：

安装于所述引物板，位于所述第三凹槽一侧与所述引物板的边沿相扣的盖子。

优选地，所述固定板和所述96孔反应板平铺于所述试剂盒本体的底部位置处。

优选地，各所述离心盒和各所述试管上均还包括刻蚀层。

优选地，所述试剂盒本体具体为正方体。

相比于现有技术，本申请所提供的一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，除了包括试剂盒本体之外，还包括位于试剂盒本体的固定板、引物板以及96孔PCR反应板；固定板上设置有用于固定引物板的第一凹槽和用于放置各离心管的第二凹槽，第二凹槽的个数与离心管的个数一一对应；引物板上设置有用于放置装有多种目标引物的多个试管的第三凹槽，第三凹槽的个数与试管的个数一一对应，一个试管装有一种目标引物，试管出口处安装有螺旋密封的盖子。也就是说，该试剂盒中包含有用于盛放多种目标引物的多个试管的引物板，实际需要检测多少种引物(感染源)，就在引物板上设置多少个第三凹槽，放置多少个试管，可以实现对多种感染源的检测诊断，提高感染源的检测准确性，进而可以确保临床精准诊断感染病原体类型和调整用药策略，降低患者死亡率。

附图说明

为了更清楚的说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简要的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本实用新型实施例所提供的一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒结构图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。

本申请的核心是提供一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，可以解决现有技术中如何增加感染源的检测种类、提高感染源的检测准确性以使临床精准诊断感染病原体类型和调整用药策略，降低患者死亡率。

图1为本实用新型实施例所提供的一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒结构图，如图1所示，该诊断试剂盒包括试剂盒本体1，还包括：

位于试剂盒本体1的固定板10、引物板11以及96孔PCR反应板12；

固定板10上设置有用于固定引物板11的第一凹槽100和用于放置各离心管13的第二凹槽101，第二凹槽101的个数与离心管13的个数一一对应；

引物板11上设置有用于放置装有多种目标引物的多个试管14的第三凹槽110，第三凹槽110的个数与试管14的个数一一对应，一个试管14装有一种目标引物，试管14出口处安装有螺旋密封的盖子140。

具体地，试剂盒本体1主要就是指试剂盒的外壳，可以是硬纸盒，也可以是塑料盒。在本申请实施例中，试剂盒里面的固定板10可以选用泡沫板，固定板10上设置有用于放置引物板11的第一凹槽100，第一凹槽100的尺寸以能使引物板11全部或部分固定镶嵌于第一凹槽100为准。固定板10上还设置有用于放置各离心管13(EP管)的第二凹槽101，离心管13主要用于盛放患者脑脊液、从该脑脊液中提取的DNA提取液以及实验时需要的反应液；在实际应用中，为了防止相关人员混淆各离心管13所装的物质，进而影响诊断结果，优选地，各离心管13上还包括刻蚀层，以便在该刻蚀层上刻饰“此离心管装有XX物质”的字样，以提高诊断准确性；第二凹槽101的个数与离心管13的个数一一对应，也就是有几个离心管13，就在固定板10上设置几个第二凹槽101，离心管13的个数可根据实际情况进行确定，第二凹槽101的尺寸以能使各离心管13全部或部分固定镶嵌于第二凹槽101为准；考虑到设计的方便性以及成品的美观性，作为优选地实施方式，各第二凹槽101位于固定板10的同一侧，同时确保各第二凹槽101在固定板10的同一侧均匀分布，即同均匀位于固定板10的左侧或右侧，当第一凹槽100位于固定板10的左侧时，各第二凹槽101均匀位于固定板10的右侧，当第一凹槽100位于固定板10的右侧时，各第二凹槽101均匀位于固定板10的左侧，当然，各第二凹槽101还可以在固定板10上以其它方式分布，并不局限于本申请实施例中的分布方式。在实际应用中，本申请实施例中的试剂盒的尺寸可根据实际情况进行确定，本实用新型并不作限定。

试剂盒里面的引物板11可以选用橡胶板，引物板11上设置有用于放置多个试管14的第三凹槽110，试管14的个数需根据实际需要的目标引物的种类确定，一个试管14装有一种目标引物，例如，如果实际需要诊断29种引物，就需要29个试管14，引物也称为病原体或感染源，第三凹槽110的个数与试管14的个数一一对应，也就是说，有几个试管14，就需要在引物板11上设置几个第三凹槽110，第三凹槽110的尺寸以能使各试管14全部或部分固定镶嵌于第三凹槽110为准，在实际设计时，可以使第三凹槽110均匀分布于引物板11；在实际应用中，为了便于相关人员准确快速识别各试管14中所装的引物，提高诊断效率，优选地，各试管14上还包括刻蚀层，以便在该刻蚀层上刻饰“此试管14中装的引物为XX”的字样，以提高诊断效率；考虑到各目标引物的特性，试管14出口处需安装螺旋密封的盖子140，螺旋密封的盖子140的材质可根据实际情况进行确定。考虑到离心管13和试管14的外观形状，作为优选地实施方式，第二凹槽101和第三凹槽110的横截面均为圆形，当然，在实际应用中，第二凹槽101和第三凹槽110的横截面还可以为其它形状，只要可以确保离心管13全部或部分能够固定嵌入第二凹槽101和试管14全部或部分能够固定嵌入第三凹槽110即可。考虑到设计的方便性，作为优选地实施方式于，引物板11的横截面为长方形；对应地，第一凹槽100的横截面为长方形，具体就是引物板11的横截面为何种形状，第一凹槽100的横截面就设计为何种形状，即节省材料，也便于固定引物板11。考虑到实际操作的便捷性，作为优选地实施方式，固定板10和96孔PCR反应板12平铺于试剂盒本体1的底部位置处，当然，还可以将固定板10和96孔PCR反应板12堆叠放置，本实用新型并不作限定。考虑到设计的快速性以及外观的美观性，作为优选地实施方式，试剂盒本体1具体为正方体。当然，试剂盒本体1的具体形状并不局限于本申请实施例中的形状，也可以设计成其它形状，本实用新型并不作限定。

96孔PCR反应板12上一般设置有96个反应槽120，反应槽120中用于存放反应液(DNA提取液和多种目标引物的混合物)，96孔PCR反应板12的结构与现有技术中的96孔PCR反应板的结构一样，具体可参见现有技术，本实用新型在此不再赘述。

本申请实施所提供的试剂盒的储存条件为，避光保存，避免污染，-20℃运输；-20℃长期保存；反复冻融不影响使用效果；若频繁使用，建议储存于4℃，4℃可保存6个月。若部分溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。注意事项为，实验前需仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照说明书执行操作。第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在缓冲液和漂洗液中加入无水乙醇。样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。若缓冲液或清洗液中有沉淀,可在37℃水浴中重新溶解,摇匀后使用。所有离心步骤均为使用台式离心机,室温下离心。样品在开始运行前应平衡至室温(15～25℃)。若要长期保存DNA样本，最好加入相应2.5倍体积的无水乙醇来沉淀DNA。混匀后便可看见白色絮状物。短暂离心后放置于-80℃低温冰箱中保存至少一年。若需使用,需在7000～8000×g的离心机中离心5min,使DNA重新沉淀，再加入TE溶液溶解DNA沉淀。必要时须重新检测DNA的纯度和浓度。MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4℃。冻结产品溶解后，请上下颠倒轻轻均匀混合，切勿过于用力，避免起泡，并轻微离心后使用。融解后的试剂请于冰上放置。反应的配置、分装一定要换新的(无污染的)枪头(不要连续用同一个枪头加样)、微型管等，尽量避免污染。在使用该试剂盒的过程中都要戴手套，如手套与样品接触，需要立即更换手套。

本申请所提供的一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒，除了包括试剂盒本体之外，还包括位于试剂盒本体的固定板、引物板以及96孔PCR反应板；固定板上设置有用于固定引物板的第一凹槽和用于放置各离心管的第二凹槽，第二凹槽的个数与离心管的个数一一对应；引物板上设置有用于放置装有多种目标引物的多个试管的第三凹槽，第三凹槽的个数与试管的个数一一对应，一个试管装有一种目标引物，试管出口处安装有螺旋密封的盖子。也就是说，该试剂盒中包含有用于盛放多种目标引物的多个试管的引物板，实际需要检测多少种引物(感染源)，就在引物板上设置多少个第三凹槽，放置多少个试管，可以实现对多种感染源的检测诊断，提高感染源的检测准确性，进而可以确保临床精准诊断感染病原体类型和调整用药策略，降低患者死亡率。

在图1的基础上，该试剂盒还包括：安装于引物板11，位于第三凹槽110一侧与引物板11的边沿相扣的盖子。具体就是引物板11上还设置有盖子，盖子可以与引物板11的边沿相扣合，在实际应用中，可以将盖子的任意一边固定安装于引物板11的一边位置处(因为引物板11的横截面为长方形，所以与之配套的盖子的横截面也应该为长方形)，剩余的其它三边在盖子扣下时，与引物板11的边沿紧密扣合，即可以防止引物板11中的试管14与空气长时间接触，也可以避免试管14在引物板11上的第三凹槽110中晃动，如果盖子是遮光材料，还可以起到避光的作用。为了进一步防止遗漏的空气进入试管14中，影响诊断的准确性，在上述实施例的基础上，作为优选地实施方式，螺旋密封的盖子140上还设置有用于密封的密封圈。具体就是在螺旋密封的盖子140上再增设一层密封圈。

为了使本领域技术人员更好地理解本方案，下面对脑脊液中的DNA提取过程以及对病原体的诊断过程进行详细说明。

第一，磁珠法提取患者脑脊液中的DNA，具体包括以下步骤：

第一步，收集1mL待测物(脑脊液)加入1.5mL离心管13。第二步，在9000rpm下离心30秒，使细胞沉淀下来，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。涡旋振荡直到细胞团充分重悬、分散。细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，细胞未打散就加入裂解液，会导致细胞不能充分裂解，形成肉眼可见团块。第三步，加入350μl Lysis BufferA重悬的细胞，上下吹打裂解细胞，或者剧烈涡旋10秒帮助裂解细胞，70℃水浴10min。第四步(在实际操作时，执行或者不执行该步骤对提取结果均没有影响)，在裂解物中加入RNase A(10mg\/ml)至终浓度10μg\/ml，颠倒25次混匀，37℃温育15分钟去除残留RNA，然后冷却回室温。第五步，加入冰冷的150μl SolutionAB后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25秒，混匀后可能见到一些小的蛋白团块。第六步，12000rpm(可根据需要调整加大离心力)离心5分钟，此时可以见到管底暗褐色或是白色的块状沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。第七步，小心吸取上清(大约400μl)到一个新的1.5ml离心管13中。吸取上清时，注意不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀。如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管13中，可再次离心2分钟后取上清。第八步，加入等体积的室温BindingBuffer PQ 400μl和20μl MagDNA磁珠，立刻上下颠倒20次充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，也可能会形成一团或是类似双螺旋的丝状物质，在实际操作时，不能吸走黑色团块。第九步，将离心管13放到磁性分离架上静止1-2min，直到溶液变澄清，小心的吸掉液体，不要吸到磁珠。第十步，取下1.5ml离心管13，加入500μl杂质去除缓冲液Wash Buffer B(请先检查是否已加入无水乙醇)颠倒混匀，将1.5ml离心管13放到磁性分离架上静止1-2分钟，直到溶液变澄清，小心地吸掉液体。第十一步，加入600μl漂洗液Wash Buffer C(请先检查是否已加入无水乙醇)，颠倒混匀，将1.5ml离心管13放到磁性分离架上静止1-2min，直到溶液变澄清，小心的吸掉液体，弃掉废液。第十二步，加入500μlWash Buffer D漂洗液(请先检查是否已加入无水乙酵)，颠倒混匀，将离心管13放到磁性分离架上静止1-2min,直到溶液变澄清，小心的吸掉液体，弃掉废液。(尽可能的吸掉残余液体，以免影响实验结果)。第十三步，取下1.5ml离心管13，将其放置在37-65℃的烘箱中晾干残余乙醇。(也可用吹风机吹2-3min即可，不要太干，以免DNA难以溶解)。第十四步，加入50-100μl洗脱缓冲液轻轻弹动管壁，将磁珠完全打散分散在洗脱缓冲液中，室温放置1-2min(洗脱缓冲液在65-70℃水浴中预热效果更好，如果要得到更高浓度的DNA可以减少洗脱体积，也可分两次洗脱)。第十五步，将离心管13放到磁性分离架上静止1-2mim，直到溶液变澄清，小心的转移溶液到一新的离心管13中，不要吸到磁珠，如果吸到磁珠可重新放置在磁力架上分离。第十六步，得到DNA提取液之后，可以将其存放在2-8℃环境下，如果要长时间存放，可以放置在-20℃环境下。

第二，对提取的DNA纯度进行鉴定。

因为纯的DNA\/RNA的OD260\/OD280为1.8或2.0，故根据OD260\/OD280的比值就可估计出DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230\/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。具体地，若OD260\/OD280的比值R大于1.8，说明存在RNA，可重新用RNaseA处理。若R值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化(也可加入1\/8体积的3MNaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。

第二，对患者脑脊液中的感染源进行检测。

第一步，配置引物溶液。开盖前请先离心(4000rpm，30～60s)；缓慢打开试管14上的螺旋密封的盖子140，加入适量的缓冲溶液或水；拧上螺旋密封的盖子140后充分震荡混匀；暂时不用或长期储存需要放在-20℃冷藏。

第二步，首先，按表1的方式配置PCR反应液。

表1 PCR反应液配比

设计图

一种用于脑脊液疑难病原体诊断的试剂盒论文和设计

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