水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

论文摘要

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体（bbu-miR-302s）,对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞（iPSC）。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×106TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 引物设计与合成
•     1.2.2 bbu-miR-302s真核表达载体的构建
•     1.2.3 pLVX-IRES-ZsGreen1-302s慢病毒颗粒的生产及载体有效性检测
•     1.2.4 bbu-miR-302s生物信息学分析
•     1.2.5 bbu-miR-302s重编程BFF为iPSC
•     1.2.6 AP染色
• 2 结 果
•   2.1 水牛miR-302s基因全序列扩增及pLVX-IRES-ZsGreen1-302重组质粒的构建
•   2.2 水牛miR-302s慢病毒真核载体的有效性检测
•   2.3 bbu-miR-302s基因家族生物信息学分析
•     2.3.1 miR-302s基因家族序列及其在基因组中的定位
•     2.3.2 bbu-miR-302s基因家族成熟序列与种子序列保守
•     2.3.3 miR-302s靶基因预测及生物信息学分析
•   2.4 bbu-miR-302s单因子重编程BFF
• 3 讨 论
• 4 结 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 乔树叶,黄时海,邓彦飞,邓海莹,罗婵,石德顺,李湘萍

关键词: 慢病毒真核载体,生物信息学分析

来源: 中国畜牧兽医 2019年09期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西大学生命科学技术学院,广西大学动物科学技术学院

基金: 国家自然科学基金(31560632),广西自然科学基金(2016GXNSFDA380030)

分类号: Q78

DOI: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2019.09.001

页码: 2497-2506

总页数: 10

文件大小: 5341K

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