导读:本文包含了输出小管论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:睾丸,小管,蛋白,己烯,受体,大鼠,免疫。
输出小管论文文献综述
狄钰,陈东山,阎磊[1]（2019）在《经睾丸输出小管注射慢病毒对Wistar大鼠生殖系统的影响》一文中研究指出目的探讨慢病毒高毒性物质稳定转基因技术对雄性Wistar大鼠生殖系统的影响。方法构建PAX2稳定干扰的含有绿色荧光蛋白的慢病毒,将该病毒溶液用台盼蓝标记,通过34 G针头注入16只Wistar大鼠睾丸输出小管。2周后用超声监测睾丸实质,1个月后将大鼠处死,取出睾丸及其附属腺体,免疫荧光染色及HE染色观察组织结构形态。结果大鼠睾丸输出小管注射,共有8只注射成功,均出现不同程度的睾丸曲精小管凋亡坏死,部分小管腔内可见报告基因的高表达,附睾上皮未出现明显的转染情况,而精囊腺上皮细胞出现不同程度的绿色荧光蛋白高表达。结论睾丸和附睾不适合雄性动物的慢病毒转染,并且该处转染容易影响精子的成熟和发育,而精囊腺注射慢病毒建立转基因动物模型具有可行性。(本文来源于《山东大学学报(医学版)》期刊2019年05期）
张道来[2]（2018）在《ADGRG2对输出小管液体重吸收和男性生育能力的调控机制》一文中研究指出男性不育正在从个人问题转变为公共健康问题。这是因为大约15%处于生殖年龄的夫妇不育,而男性不育约占这种不育的50%。在男性生殖系统中,输出小管通过液体重吸收和维持水和离子代谢的稳态,在精子运输和成熟过程中发挥着重要作用。然而,输出小管液体重吸收能力的功能障碍,会导致导管阻塞和精子异常,致使人类和其他哺乳动物雄性生育障碍。ADGRG2(adhesion G-protein coupled receptor G2,粘附 G 蛋白偶联受体 G2)的基因突变,导致在输出小管中液体重吸收异常,造成男性不育症,这表明该细胞表面受体在调节液体重吸收的过程中有重要作用。然而,ADGRG2如何调控输出小管中水-离子代谢的稳态和液体重吸收的分子机制仍不清楚。ADGRG2 属于 7 次跨膜 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)超家族,GPCRs调节了大约80%的跨膜信号转导。不同类型的G蛋白和arrestins作为这些GPCRs下游的信号中心枢纽,调节GPCRs的大部分功能。在输出小管中,G蛋白和它们的平行信号分子arrestins如何调节输出小管液体重吸收和男性的生育能力仍然不清楚。一、研究目的:1.ADGRG2如何通过调控其下游的目标分子调节输出小管中水-离子代谢的稳态和液体的重吸收;2.在输出小管中,ADGRG2下游的G蛋白亚型如何调控输出小管的液体重吸收和男性的生育能力;3.在输出小管中,p-arrestins在调节输出小管液体重吸收和男性的生育能力方面的作用;4.ADGRG2胞内环的特定氨基酸残基对ADGRG2与G蛋白亚型偶联的影响及对输出小管液体重吸收和男性生育能力的影响;5.在Adgrg2-/Y小鼠中的条件表达野生型ADGRG2能否挽救Adgrg2-Y小鼠生殖缺陷表型。二、研究方法主要的研究方法简述如下:1.附睾和输出小管膜成分的制备用于Western blot和免疫共沉淀的检测;2.输出小管的分离和结扎用于检测在不同的实验条件下,输出小管直径的变化;3.重组腺病毒和慢病毒的构建,用于小鼠的在体感染或者分离输出小管组织的感染;4.利用pH值敏感的荧光探针carboxy-SNARF(?)-1测量细胞内的pH值;5.实时定量PCR(qRT-PCR)检测组织和细胞中G蛋白,p-arrestins和渗透性驱动因子的mRNA转录;6.免疫荧光染色检测输出小管中各种相关蛋白的表达及定位情况;7.小鼠附睾输出小管上皮细胞培养,用于qRT-PCR分析和电生理的相关实验;8.免疫共沉淀检测输出小管中相关蛋白和蛋白之间的相互作用;9.全细胞膜片钳记录用于分离的输出小管上皮细胞和体外转染的HEK293细胞的电生理检测;10.cAMP和IP1 ELISA检测组织中cAMP和IP1的水平;11.GloSensor cAMP 检测 HEK293 细胞中 cAMP 水平;12.NFAT双荧光素酶报告系统分析HEK293细胞中Ca2+水平;13.组织HE染色,检测相关的形态学指标;14.用CFTR siRNAdicer处理小鼠输出小管用于检测CFTR敲低对非纤毛细胞的影响;15.统计学分析:所有的数据均以均值±标准差的形式显示,统计学比较采用带有ANOVA的GraphPad Prism5软件,p<0.05为差异有显着性。叁、结果1.Gq活性是输出小管液体重吸收和男性生育力所必需的ADGRG2在输出小管的没有乙酰化微管蛋白染色的细胞中定位,表明它在非纤毛细胞中特异表达。非纤毛细胞的Golf、Gi2、Gq、G11和G13表达水平高于脑组织,而Gs、G12和Gz的表达水平则和脑组织的表达水平相似。使用特定的药物干预和敲除模型研究不同的G蛋白亚型信号通路在输出小管中液体重吸收的作用。野生型(WT)小鼠由于输出小管腔内液体的正常吸收而没有显示出管腔直径的改变,但是从Adgrg2-/Y小鼠中得到的结扎输出小管在72 h的体外培养后,输出小管腔的直径增加了40%。相应的,应用Gq蛋白水平降低50%的Gnaq+/-小鼠或蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220,显着地削弱了输出小管的液体重吸收,这模仿了从Adgrg2-/Y小鼠中获得的输出小管表型,这表明Gq-PKC信号对于有效的液体重吸收是必需的。与WT小鼠相比,Gnaq+/-小鼠的输出小管始终表现为梗阻性精子的积累,而Gnaq+/-小鼠的附睾起始部和附睾头部区域内的空腔显示精子水平的下降。与同窝的WT小鼠相比,从Gnaq+/-小鼠附睾尾部获取的精子数和Gnaq+/-小鼠的出生率都显着下降。这些数据表明,在不同的G蛋白亚型中,Gq的活性对于输出小管进行液体重吸收和男性生育能力是必需的。2.输出小管中ADGRG2和CFTR偶联及其在输出小管液体重吸收中的作用我们检测了液体分泌和吸收的潜在渗透性驱动因子在输出小管和ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中的表达水平。其中,NKCC、DRA、CFTR、SLC26a9、NHE3和Cavl.3在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中有较高的表达。接下来使用一系列药理学阻滞剂来检测这些膜蛋白功能的不适当调控是否参与了输出小管中由ADGRG2或Gq介导的液体重吸收。在应用GlyH-101或CFTRinh-172阻断CFTR活性对输出小管内的液体重吸收有显着影响,并复制了Adgrg2-/Y小鼠的表型。因ADGRG2的失活和在WT小鼠中应用CFTR通道阻滞剂引起的表型提示CFTR和ADGRG2在输出小管液体重吸收的调节过程中可能有功能联系。CFTR是生殖和肾脏系统中pH平衡和氯离子的关键调节子,在液体的重吸收中具有重要作用。/Adgrg2-/Y小鼠的pH值稳态受损,输出小管内溶液的pH值为7.6,而同窝的WT小鼠的pH值为7.2。此外,CFTR抑制剂CF-TRinh-172的应用使WT小鼠的输出小管的pH值增加了约0.3,但对Adgrg2-/Y小鼠的pH值没有显着影响,提示Adgrg2-/Y小鼠的CFTR功能障碍影响pH稳态。特别地,ADGRG2和CFTR在输出小管非纤毛细胞的结构顶膜上有明确的共定位,同时ADGRG2与CFTR具有免疫沉淀相关性。以上这些结果表明在输出小管非纤毛细胞中ADGRG2和CFTR能够形成复合物并且能够功能偶联。3.ADGRG2启动子-RFP标记的输出小管非纤毛细胞的全细胞Cl-电流然后,我们记录了来自WT和Adgrg2-/Y小鼠中由ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流。从WT小鼠中提取的ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞的膜片钳记录显示一个可逆的全细胞Cl-电流,这在外液用葡萄糖酸盐(gluconate,Gluc-)取代时显着降低。这种全细胞Cl-电流在用Cl溶液代替后恢复。相比之下,Adgrg2-/Y小鼠的全细胞Cl电流显着低于其同窝WT小鼠的全细胞Cl电流,在使用含Gluc-的洗液替代Cl溶液后的反应没有明显的变化。这些结果提示,在输出小管内ADGRG2缺失显着降低了 ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞的全细胞Cl电流。4.CFTR介导了 ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流接下来,我们研究了不同的Cl通道和转运蛋白抑制剂对从Adgrg2-/Y小鼠和同窝的WT小鼠中获得的非纤毛细胞全细胞Cl电流的影响。特异性CFTR抑制剂CFTRinh-172显着降低了全细胞Cl-电流电流。此外,应用CFTRinh-172可消除Adgrg2-/Y小鼠与同窝的WT小鼠之间全细胞Cl-电流的差异。当我们在输出小管中降低CFTR的表达,WT小鼠的全细胞Cl-电流显着降低。这些结果表明,CFTR在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中被激活,这些细胞介导了外向全细胞Cl-电流,而ADGRG2则是CFTR在这些细胞中激活的基本的必要条件。5.在输出小管中,Gq活性对于ADGRG2/CFTR的偶联是必需的与Adgrg2-/Y小鼠相似,从Gnaq+/-小鼠中得到的输出小管在pH稳态中表现出不平衡。同样的,我们观察到在Gnaq+/-小鼠中ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流比同窝的WT小鼠中所观察到的显着降低。Gq下游效应器PKC抑制剂Ro 31-8220的应用进一步抑制了全细胞Cl-电流。这些结果表明,Gq-PKC信号通路在输出小管中对基础的CFTR激活起关键作用,它控制Cl-和pH稳态从而进行有效的液体重吸收。接下来我们研究了 CFTR功能是否需要ADGRG2对Gq的激活。在输出小管中,Gq位于ADGRG2表达的细胞中。同时,Gq在ADGRG2抗体免疫沉淀复合物中很容易被检测到,这表明,在输出小管中,ADGRG2与Gq之间有物理相互作用。此外,从Adgrg2-/Y小鼠中获得的结扎输出小管的内源性游离态IP1和cAMP水平显着低于其同窝WT小鼠。综上所述,这些数据表明Gq通过介导ADGRG2/CFTR偶联调节输出小管的液体重吸收,Gq-IP3-PKC通路在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中被激活。6.由p-arrestin-1而不是p-arrestin-2介导的ADGRG2/CFTR复合物的形成在输出小管的液体重吸收过程中至关重要我们研究了Arrb1-/-和Arrb2-/-小鼠输出小管的液体重吸收,与同窝的WT小鼠相比,Arrb2-/-小鼠的输出小管表现出正常的液体吸收和pH值稳态,而从Arrb1-/-小鼠中获得的输出小管的功能明显受损。此外,Arrb2-/-或WT小鼠的ADGRG2和CFTR在非纤毛细胞的结构顶膜区共同定位,而在Arrb1-/-小鼠中则表现为分离。在p-arrestin-1缺失的输出小管,CFTR的定位远离Ezrin表明β-arrestin-1对于CFTR的正确定位是必需的。同样的,在WT和Arrb2-/-小鼠中CFTR能够和ADGRG2免疫共沉淀,而源自Arrb1-/-小鼠的输出小管ADGRG2-免疫沉淀复合物中没有发现CFTR和ADGRG2的相互作用,进一步表明在输出小管中β-arrestin-1在包含ADGRG2和CFTR信号复合体中是一个重要的组件。7.ADGRG2与G蛋白亚型偶联的分子决定簇及其在体外实验中对CFTR活性的调节在体外,ADGRG2的过表达导致了其组成性Gs和Gq偶联活性。进行全细胞膜片钳记录以检测ADGRG2和CFTR共表达后对膜电流的影响。ADGRG2和CFTR的共表达显着增加了电流响应的幅度和倾角,与仅用CFTR进行转染的细胞相比,CFTR抑制剂CFTRinh-172显着降低了电流响应的幅度和倾角,表明CFTR通道在重组系统中被ADGRG2激活。重要的是,PKC抑制剂Ro 31-8220显着降低了 ADGRG2诱导的CFTR活性。综上所述,ADGRG2通过激活Gq-PLC-PKC信号通路,增加CFTR的Cl-电流。我们选择了 ADGRG2胞内环2和3中的一些突变,然后用全细胞膜片钳技术检测这些ADGRG2突变体与CFTR偶联的活性。尽管Gs信号缺陷的突变体显示ADGRG2与CFTR的偶联降低,Gq信号缺失突变体和Gs/Gq双信号缺陷突变体H696A/M697A则使ADGRG2与CFTR之间的偶联消失。这表明,ADGRG2胞内环2和3中的特定氨基酸残基是ADGRG2的G蛋白亚型偶联的决定因素。此外,在体外重组系统中,ADGRG2下游的Gq信号是CFTR激活的关键。8.野生型ADGRG2或其选择性G蛋白亚型信号突变体的条件表达对Adgrg2-/Y小鼠生殖缺陷表型挽救的影响。接下来,我们研究了 ADGRG2/G蛋白亚型的相互作用如何作用于由ADGRG2缺失导致的男性不育症。与WT小鼠相比,Adgrg2-/Y小鼠的输出小管常表现为梗阻性精子积累,附睾尾部的精子数量明显减少,并出现形态异常的精子。在Adgrg2-/Y小鼠中,非纤毛细胞ADGRG2-WT的条件表达显着降低了梗阻性精子积累,使尾附睾的精子数恢复一半以上,而ADGRG2的G蛋白信号缺失突变体的表达,尤其是Gs/Gq双信号缺失突变体ADGRG2-HM696AA或Gq信号缺失突变体Y708A和RK803EE的条件表达显着降低了这一效果。为了研究上述有关精子的表型是否与输出小管液体重吸收有关,我们用ADGRG2-WT或G蛋白信号缺失突变体病毒感染后的输出小管分离培养,并测量结扎后的腔体直径。有趣的是,Gs缺失突变体Y698A和F705A的条件表达略微降低了Adgrg2-/Y 鼠的输出小管的膨胀,而Gq信号突变体对Adgrg2-/Y小鼠输出小管腔体的直径没有显着的影响。综上所述,在体内表型挽救实验中,在ADGRG2的下游Gq活性对于输出小管的液体的重吸收和精子的运输是尤为重要的。四、结论1.Gq活性是输出小管液体吸收和男性生育力所必需的。2.输出小管中的ADGRG2和CFTR偶联对输出小管的液体重吸收是必需的。3.CFTR介导了输出小管非纤毛细胞的全细胞Cl-电流。4.在输出小管中,Gq活性对于ADGRG2/CFTR的偶联是必需的。5.由p-arrestin-1而不是p-arrestin-2介导的ADGRG2/CFTR复合物的形成在输出小管的液体重吸收过程中至关重要。6.ADGRG2胞内环2和3中的特定氨基酸残基是ADGRG2与G蛋白亚型偶联的决定因素;Gq信号缺失突变体和Gs/Gq双信号缺陷突变体则使ADGRG2与CFTR之间的偶联消失。7.野生型ADGRG2在Adgrg2-/Y小鼠中的条件表达能够挽救Adgrg2-/Y小鼠生殖缺陷表型,而Gq信号缺失突变体没有挽救效果。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-23）
申复进,张茨,王将,杜贤进,熊云鹤[3]（2009）在《输出小管-睾丸网注射提高小鼠精原干细胞移植效率》一文中研究指出目的:探讨小鼠精原干细胞移植的关键技术,寻求有效可行的精原干细胞移植方法。方法:选用4-5周龄雄性BALB/c小鼠45只腹腔内注射40 mg/kg的白消安建立受体模型,消化分离新生绿色荧光小鼠睾丸精原细胞作供体细胞。在叁维显微注射系统下分别采用睾丸网注射法(n=15),输出小管注射法(n=30),经输出小管注射失败后的补救方式为经输出小管-睾丸网注射,将供体细胞注射到受体小鼠左侧睾丸精曲小管内,右侧睾丸作为对照。观察注射后精曲小管的充盈度和外漏的情况;移植后2个月观察受体小鼠的生精功能恢复情况。结果:经睾丸网注射成功率仅为35.7%(5/14),其中9只因睾丸网穿破、细胞悬液外漏到间质而失败。经输出小管注射成功率为72.4%(21/29),失败的主要原因为穿刺过程中穿破输出小管,进一步采用经输出小管-睾丸网注射补救,总成功率提高为93.1%(27/29),注射成功后可见70%-80%的精曲小管被蓝染的细胞悬液充盈,均无外漏现象。移植后2个月,体视荧光显微镜下可见移植侧睾丸包含多段绿色阳性克隆;组织学染色示移植侧睾丸大部分精曲小管恢复正常生精。结论:经输出小管和经输出小管-睾丸网显微注射技术是小鼠精原干细胞移植的有效方法。(本文来源于《武汉大学学报(医学版)》期刊2009年04期）
张泉,周新华,张孝斌,周庆辉,王得志[4]（2005）在《雌二醇对大鼠睾丸输出小管水重吸收功能的影响》一文中研究指出目的:研究苯甲酸雌二醇(E2B)对大鼠睾丸输出小管水重吸收功能的影响。方法:选取新生雄性SD大鼠为实验对象,皮下注射E2B(0.2 mg/5 g体重),分别于出生后14、21、28、42、56 d取材;对照组大鼠皮下注射玉米油。各年龄段实验和对照组大鼠各取4只,光镜下观察睾丸输出小管的组织形态改变,并测量其上皮细胞高度的变化;透射电镜下观察上皮细胞超微结构的变化;免疫组化方法观察水通道蛋白AQP-1在睾丸输出小管上皮细胞中表达的改变。结果:与对照组相比,各年龄段实验组大鼠睾丸输出小管管腔明显扩张(P<0.05),上皮细胞高度显着下降(P<0.01),非纤毛上皮细胞微绒毛短而稀少,参与水重吸收的细胞器缺乏,不表达AQP-1。结论:E2B破坏了大鼠睾丸输出小管的水重吸收功能。(本文来源于《中华男科学杂志》期刊2005年11期）
张孝斌,张泉[5]（2005）在《己烯雌酚对青春前期大鼠睾丸输出小管发育影响的研究》一文中研究指出目的:研究不同剂量的雌激素对睾丸输出小管水重吸收功能的影响,以及水重吸收功能障碍与睾丸组织发育的关系,方法:选择雄性SD大鼠作为实验对象,在生后2,4,6,8,10,12d分别皮下注射0．1,1,10μg的己烯雌酚(溶于2μl玉米油中),对照组注射等体积的玉米油,并在生后(本文来源于《第十二届全国、第七届全球华人泌尿外科学术会议论文汇编（下册）》期刊2005-11-01）
余秀平,何为民,高雅萍[6]（2005）在《结扎输出小管前后小鼠附睾表皮生长因子受体表达的变化》一文中研究指出目的:观察结扎输出小管(EDL)前后小鼠附睾表皮生长因子受体(EGFR)的变化,探讨睾丸网液成分是否影响附睾EGFR的表达。方法:应用免疫组化和图像分析方法观察并比较EDL前、EDL后3d、7d、14d小鼠(n=7)附睾起始部和体部的结构和EGFR表达。结果:EDL后,小鼠附睾起始部和体部EGFR表达强度降低。起始部EGFR阳性面积自EDL后第3天明显减少,第7天较第3天有所增加,第14天恢复到正常水平。小鼠附睾体部EGFR阳性面积在结扎早期无明显变化,到EDL后第14天明显增加。EDL后第3天起,小鼠附睾起始部管壁和管腔面积显着减少。EDL后第14天附睾体部管壁和管腔面积减少。结论:睾丸网液的成分通过不同作用机制影响附睾起始部和体部的结构和EGFR的表达。(本文来源于《解剖学杂志》期刊2005年02期）
张良[7]（2004）在《己烯雌酚对大鼠睾丸输出小管上皮细胞水通道蛋白-1表达的影响》一文中研究指出雄性动物的生殖系统中也能产生雌激素，雌激素主要通过与雌激素受体结合发挥生物学作用。本实验室前期的研究发现睾丸输出小管表达有丰富的雌激素受体。睾丸输出小管连接在睾丸网和附睾管之间，具有重吸收功能，其功能的损害可能导致雄性生殖功能的损害。因此本实验希望探讨雌激素与睾丸输出小管重吸收功能之间的关系。首先我们利用免疫组织化学观察与水分重吸收功能相关的蛋白-水通道蛋白-1(AQP-1)在成年Wistar大鼠睾丸输出小管上皮细胞中的分布。其次在新生儿期给予己烯雌酚(DES)，观察对双侧睾丸和附睾总重量、睾丸输出小管管腔形态及睾丸输出小管上皮细胞AQP-1免疫染色的影响。对双侧睾丸和附睾总重量、图像处理后的睾丸输出小管上皮高度及AQP-1免疫染色的平均灰度质结果进行统计学分析。实验结果显示：成年Wistar大鼠睾丸输出小管非纤毛上皮细胞的刷状缘及基侧部AQP-1阳性表达强烈，核上区的胞内体的质膜上也有阳性表达；纤毛上皮细胞的纤毛亦呈阳性反应。新生儿期给予DES的大鼠，双侧睾丸和附睾总重量在10天组没有明显的改变外，其他各年龄组均有显着性的降低，18天组下降了55％，25天组下降了47％，35天组和60天组下降了80％。HE结果显示对照组的睾丸输出小管我们可以凭借其不规则的管腔加以辨认，然而DES处理组仅仅从管腔的规则与否已经不能做到准确的区别。睾丸输出小管的扩张，上皮高度的下降变得扁平使它的管腔也变得圆滑，但是在HE染色下纤毛上皮细胞的长长的纤毛被染成红色倒成了辨别睾丸输出小管的标志。另外随着鼠龄的增加上皮高度在对照组呈增加趋势，而DES组增加却不明显。各个年龄阶段与对照组相比均有明显的下降，具有统计学意义。10天组平均高度下降了45％，18天组平均高度下降了41％，25天组平均高度下降了37％，35天组平均高度下降了71％，60天组平均高度下降了69％。免疫组织化学结果显示AQP-1的染色强度在对照组各年龄组之间观察不到有明显的差异。经DES处理后管腔扩张，上皮细胞变得扁平。AQP-1的染色强度明显下降，平均灰度值各年龄组处理组与对照组之间有明显差异。在10天组下降了40％，18天组下降了36％，25天组下降了42％，35天组下降了32％，60天组下降了30％。处理组各年龄组之间AQP一1的染色强度差异不太明显。根据以上结果，我们认为AQP一1可能主要与辜丸输出小管非纤毛上皮细胞在水重吸收功能方面有密切关系;不恰当给予雌激素可能会损害翠丸输出小管的重吸收功能，并由此影响雄性的生殖功能。(本文来源于《武汉大学》期刊2004-04-01）
张良,黄铁柱,周新华,张泉,王得志[8]（2003）在《Aquaporin-1在大鼠睾丸输出小管的免疫组织化学定位研究》一文中研究指出目的 研究正常大鼠睾丸输出小管上皮细胞上Aquaporin 1(AQP 1)的定位分布以期了解其在水重吸收上的作用机制。方法 对正常Wistar大鼠睾丸输出小管进行常规免疫组织化学方法染色观察。结果 在睾丸输出小管非纤毛上皮细胞的刷状缘及基侧部AQP 1阳性表达强烈 ,核上区的胞内体的质膜上也有阳性表达 ;纤毛上皮细胞的纤毛亦呈阳性反应。结论 Aquaporin 1可能与睾丸输出小管非纤毛上皮细胞水重吸收功能有密切关系。(本文来源于《中国组织化学与细胞化学杂志》期刊2003年03期）
输出小管论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
男性不育正在从个人问题转变为公共健康问题。这是因为大约15%处于生殖年龄的夫妇不育,而男性不育约占这种不育的50%。在男性生殖系统中,输出小管通过液体重吸收和维持水和离子代谢的稳态,在精子运输和成熟过程中发挥着重要作用。然而,输出小管液体重吸收能力的功能障碍,会导致导管阻塞和精子异常,致使人类和其他哺乳动物雄性生育障碍。ADGRG2(adhesion G-protein coupled receptor G2,粘附 G 蛋白偶联受体 G2)的基因突变,导致在输出小管中液体重吸收异常,造成男性不育症,这表明该细胞表面受体在调节液体重吸收的过程中有重要作用。然而,ADGRG2如何调控输出小管中水-离子代谢的稳态和液体重吸收的分子机制仍不清楚。ADGRG2 属于 7 次跨膜 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)超家族,GPCRs调节了大约80%的跨膜信号转导。不同类型的G蛋白和arrestins作为这些GPCRs下游的信号中心枢纽,调节GPCRs的大部分功能。在输出小管中,G蛋白和它们的平行信号分子arrestins如何调节输出小管液体重吸收和男性的生育能力仍然不清楚。一、研究目的:1.ADGRG2如何通过调控其下游的目标分子调节输出小管中水-离子代谢的稳态和液体的重吸收;2.在输出小管中,ADGRG2下游的G蛋白亚型如何调控输出小管的液体重吸收和男性的生育能力;3.在输出小管中,p-arrestins在调节输出小管液体重吸收和男性的生育能力方面的作用;4.ADGRG2胞内环的特定氨基酸残基对ADGRG2与G蛋白亚型偶联的影响及对输出小管液体重吸收和男性生育能力的影响;5.在Adgrg2-/Y小鼠中的条件表达野生型ADGRG2能否挽救Adgrg2-Y小鼠生殖缺陷表型。二、研究方法主要的研究方法简述如下:1.附睾和输出小管膜成分的制备用于Western blot和免疫共沉淀的检测;2.输出小管的分离和结扎用于检测在不同的实验条件下,输出小管直径的变化;3.重组腺病毒和慢病毒的构建,用于小鼠的在体感染或者分离输出小管组织的感染;4.利用pH值敏感的荧光探针carboxy-SNARF(?)-1测量细胞内的pH值;5.实时定量PCR(qRT-PCR)检测组织和细胞中G蛋白,p-arrestins和渗透性驱动因子的mRNA转录;6.免疫荧光染色检测输出小管中各种相关蛋白的表达及定位情况;7.小鼠附睾输出小管上皮细胞培养,用于qRT-PCR分析和电生理的相关实验;8.免疫共沉淀检测输出小管中相关蛋白和蛋白之间的相互作用;9.全细胞膜片钳记录用于分离的输出小管上皮细胞和体外转染的HEK293细胞的电生理检测;10.cAMP和IP1 ELISA检测组织中cAMP和IP1的水平;11.GloSensor cAMP 检测 HEK293 细胞中 cAMP 水平;12.NFAT双荧光素酶报告系统分析HEK293细胞中Ca2+水平;13.组织HE染色,检测相关的形态学指标;14.用CFTR siRNAdicer处理小鼠输出小管用于检测CFTR敲低对非纤毛细胞的影响;15.统计学分析:所有的数据均以均值±标准差的形式显示,统计学比较采用带有ANOVA的GraphPad Prism5软件,p<0.05为差异有显着性。叁、结果1.Gq活性是输出小管液体重吸收和男性生育力所必需的ADGRG2在输出小管的没有乙酰化微管蛋白染色的细胞中定位,表明它在非纤毛细胞中特异表达。非纤毛细胞的Golf、Gi2、Gq、G11和G13表达水平高于脑组织,而Gs、G12和Gz的表达水平则和脑组织的表达水平相似。使用特定的药物干预和敲除模型研究不同的G蛋白亚型信号通路在输出小管中液体重吸收的作用。野生型(WT)小鼠由于输出小管腔内液体的正常吸收而没有显示出管腔直径的改变,但是从Adgrg2-/Y小鼠中得到的结扎输出小管在72 h的体外培养后,输出小管腔的直径增加了40%。相应的,应用Gq蛋白水平降低50%的Gnaq+/-小鼠或蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220,显着地削弱了输出小管的液体重吸收,这模仿了从Adgrg2-/Y小鼠中获得的输出小管表型,这表明Gq-PKC信号对于有效的液体重吸收是必需的。与WT小鼠相比,Gnaq+/-小鼠的输出小管始终表现为梗阻性精子的积累,而Gnaq+/-小鼠的附睾起始部和附睾头部区域内的空腔显示精子水平的下降。与同窝的WT小鼠相比,从Gnaq+/-小鼠附睾尾部获取的精子数和Gnaq+/-小鼠的出生率都显着下降。这些数据表明,在不同的G蛋白亚型中,Gq的活性对于输出小管进行液体重吸收和男性生育能力是必需的。2.输出小管中ADGRG2和CFTR偶联及其在输出小管液体重吸收中的作用我们检测了液体分泌和吸收的潜在渗透性驱动因子在输出小管和ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中的表达水平。其中,NKCC、DRA、CFTR、SLC26a9、NHE3和Cavl.3在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中有较高的表达。接下来使用一系列药理学阻滞剂来检测这些膜蛋白功能的不适当调控是否参与了输出小管中由ADGRG2或Gq介导的液体重吸收。在应用GlyH-101或CFTRinh-172阻断CFTR活性对输出小管内的液体重吸收有显着影响,并复制了Adgrg2-/Y小鼠的表型。因ADGRG2的失活和在WT小鼠中应用CFTR通道阻滞剂引起的表型提示CFTR和ADGRG2在输出小管液体重吸收的调节过程中可能有功能联系。CFTR是生殖和肾脏系统中pH平衡和氯离子的关键调节子,在液体的重吸收中具有重要作用。/Adgrg2-/Y小鼠的pH值稳态受损,输出小管内溶液的pH值为7.6,而同窝的WT小鼠的pH值为7.2。此外,CFTR抑制剂CF-TRinh-172的应用使WT小鼠的输出小管的pH值增加了约0.3,但对Adgrg2-/Y小鼠的pH值没有显着影响,提示Adgrg2-/Y小鼠的CFTR功能障碍影响pH稳态。特别地,ADGRG2和CFTR在输出小管非纤毛细胞的结构顶膜上有明确的共定位,同时ADGRG2与CFTR具有免疫沉淀相关性。以上这些结果表明在输出小管非纤毛细胞中ADGRG2和CFTR能够形成复合物并且能够功能偶联。3.ADGRG2启动子-RFP标记的输出小管非纤毛细胞的全细胞Cl-电流然后,我们记录了来自WT和Adgrg2-/Y小鼠中由ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流。从WT小鼠中提取的ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞的膜片钳记录显示一个可逆的全细胞Cl-电流,这在外液用葡萄糖酸盐(gluconate,Gluc-)取代时显着降低。这种全细胞Cl-电流在用Cl溶液代替后恢复。相比之下,Adgrg2-/Y小鼠的全细胞Cl电流显着低于其同窝WT小鼠的全细胞Cl电流,在使用含Gluc-的洗液替代Cl溶液后的反应没有明显的变化。这些结果提示,在输出小管内ADGRG2缺失显着降低了 ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞的全细胞Cl电流。4.CFTR介导了 ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流接下来,我们研究了不同的Cl通道和转运蛋白抑制剂对从Adgrg2-/Y小鼠和同窝的WT小鼠中获得的非纤毛细胞全细胞Cl电流的影响。特异性CFTR抑制剂CFTRinh-172显着降低了全细胞Cl-电流电流。此外,应用CFTRinh-172可消除Adgrg2-/Y小鼠与同窝的WT小鼠之间全细胞Cl-电流的差异。当我们在输出小管中降低CFTR的表达,WT小鼠的全细胞Cl-电流显着降低。这些结果表明,CFTR在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中被激活,这些细胞介导了外向全细胞Cl-电流,而ADGRG2则是CFTR在这些细胞中激活的基本的必要条件。5.在输出小管中,Gq活性对于ADGRG2/CFTR的偶联是必需的与Adgrg2-/Y小鼠相似,从Gnaq+/-小鼠中得到的输出小管在pH稳态中表现出不平衡。同样的,我们观察到在Gnaq+/-小鼠中ADGRG2启动子-RFP标记的非纤毛细胞的全细胞Cl-电流比同窝的WT小鼠中所观察到的显着降低。Gq下游效应器PKC抑制剂Ro 31-8220的应用进一步抑制了全细胞Cl-电流。这些结果表明,Gq-PKC信号通路在输出小管中对基础的CFTR激活起关键作用,它控制Cl-和pH稳态从而进行有效的液体重吸收。接下来我们研究了 CFTR功能是否需要ADGRG2对Gq的激活。在输出小管中,Gq位于ADGRG2表达的细胞中。同时,Gq在ADGRG2抗体免疫沉淀复合物中很容易被检测到,这表明,在输出小管中,ADGRG2与Gq之间有物理相互作用。此外,从Adgrg2-/Y小鼠中获得的结扎输出小管的内源性游离态IP1和cAMP水平显着低于其同窝WT小鼠。综上所述,这些数据表明Gq通过介导ADGRG2/CFTR偶联调节输出小管的液体重吸收,Gq-IP3-PKC通路在ADGRG2启动子标记的非纤毛细胞中被激活。6.由p-arrestin-1而不是p-arrestin-2介导的ADGRG2/CFTR复合物的形成在输出小管的液体重吸收过程中至关重要我们研究了Arrb1-/-和Arrb2-/-小鼠输出小管的液体重吸收,与同窝的WT小鼠相比,Arrb2-/-小鼠的输出小管表现出正常的液体吸收和pH值稳态,而从Arrb1-/-小鼠中获得的输出小管的功能明显受损。此外,Arrb2-/-或WT小鼠的ADGRG2和CFTR在非纤毛细胞的结构顶膜区共同定位,而在Arrb1-/-小鼠中则表现为分离。在p-arrestin-1缺失的输出小管,CFTR的定位远离Ezrin表明β-arrestin-1对于CFTR的正确定位是必需的。同样的,在WT和Arrb2-/-小鼠中CFTR能够和ADGRG2免疫共沉淀,而源自Arrb1-/-小鼠的输出小管ADGRG2-免疫沉淀复合物中没有发现CFTR和ADGRG2的相互作用,进一步表明在输出小管中β-arrestin-1在包含ADGRG2和CFTR信号复合体中是一个重要的组件。7.ADGRG2与G蛋白亚型偶联的分子决定簇及其在体外实验中对CFTR活性的调节在体外,ADGRG2的过表达导致了其组成性Gs和Gq偶联活性。进行全细胞膜片钳记录以检测ADGRG2和CFTR共表达后对膜电流的影响。ADGRG2和CFTR的共表达显着增加了电流响应的幅度和倾角,与仅用CFTR进行转染的细胞相比,CFTR抑制剂CFTRinh-172显着降低了电流响应的幅度和倾角,表明CFTR通道在重组系统中被ADGRG2激活。重要的是,PKC抑制剂Ro 31-8220显着降低了 ADGRG2诱导的CFTR活性。综上所述,ADGRG2通过激活Gq-PLC-PKC信号通路,增加CFTR的Cl-电流。我们选择了 ADGRG2胞内环2和3中的一些突变,然后用全细胞膜片钳技术检测这些ADGRG2突变体与CFTR偶联的活性。尽管Gs信号缺陷的突变体显示ADGRG2与CFTR的偶联降低,Gq信号缺失突变体和Gs/Gq双信号缺陷突变体H696A/M697A则使ADGRG2与CFTR之间的偶联消失。这表明,ADGRG2胞内环2和3中的特定氨基酸残基是ADGRG2的G蛋白亚型偶联的决定因素。此外,在体外重组系统中,ADGRG2下游的Gq信号是CFTR激活的关键。8.野生型ADGRG2或其选择性G蛋白亚型信号突变体的条件表达对Adgrg2-/Y小鼠生殖缺陷表型挽救的影响。接下来,我们研究了 ADGRG2/G蛋白亚型的相互作用如何作用于由ADGRG2缺失导致的男性不育症。与WT小鼠相比,Adgrg2-/Y小鼠的输出小管常表现为梗阻性精子积累,附睾尾部的精子数量明显减少,并出现形态异常的精子。在Adgrg2-/Y小鼠中,非纤毛细胞ADGRG2-WT的条件表达显着降低了梗阻性精子积累,使尾附睾的精子数恢复一半以上,而ADGRG2的G蛋白信号缺失突变体的表达,尤其是Gs/Gq双信号缺失突变体ADGRG2-HM696AA或Gq信号缺失突变体Y708A和RK803EE的条件表达显着降低了这一效果。为了研究上述有关精子的表型是否与输出小管液体重吸收有关,我们用ADGRG2-WT或G蛋白信号缺失突变体病毒感染后的输出小管分离培养,并测量结扎后的腔体直径。有趣的是,Gs缺失突变体Y698A和F705A的条件表达略微降低了Adgrg2-/Y 鼠的输出小管的膨胀,而Gq信号突变体对Adgrg2-/Y小鼠输出小管腔体的直径没有显着的影响。综上所述,在体内表型挽救实验中,在ADGRG2的下游Gq活性对于输出小管的液体的重吸收和精子的运输是尤为重要的。四、结论1.Gq活性是输出小管液体吸收和男性生育力所必需的。2.输出小管中的ADGRG2和CFTR偶联对输出小管的液体重吸收是必需的。3.CFTR介导了输出小管非纤毛细胞的全细胞Cl-电流。4.在输出小管中,Gq活性对于ADGRG2/CFTR的偶联是必需的。5.由p-arrestin-1而不是p-arrestin-2介导的ADGRG2/CFTR复合物的形成在输出小管的液体重吸收过程中至关重要。6.ADGRG2胞内环2和3中的特定氨基酸残基是ADGRG2与G蛋白亚型偶联的决定因素;Gq信号缺失突变体和Gs/Gq双信号缺陷突变体则使ADGRG2与CFTR之间的偶联消失。7.野生型ADGRG2在Adgrg2-/Y小鼠中的条件表达能够挽救Adgrg2-/Y小鼠生殖缺陷表型,而Gq信号缺失突变体没有挽救效果。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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