马BMSCs成软骨细胞诱导分化过程中关键lncRNA与mRNA的筛选与互作

论文摘要

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一类存在于骨髓基质内的多能干细胞。BMSCs因易分离且含量丰富,已成为组织工程和再生医学领域比较理想的种子细胞。马在运动竞技过程中常发生软骨或骨损伤,采用BMSCs对其软骨和骨修复的细胞治疗已应用于临床多年,但对BMSCs在体内、体外向软骨细胞分化的调控机制尚不清晰。长非编码RNA（lncRNA）是长度>200nt的非蛋白质编码转录物,可在多种细胞生物学过程中发挥重要的调节作用。研究证实,lncRNA可通过调节其靶基因进而影响软骨细胞分化和功能的发挥,但其详细调控机制的研究鲜有报道。鉴于此,本研究通过转录组测序技术,筛选马BMSCs向软骨细胞诱导分化过程中差异表达的lncRNA及其作用的靶基因,并初步建立参与软骨形成相关的lncRNA与其靶基因之间的调控网络,揭示调节BMSCs向软骨细胞分化的分子调控机制。主要研究结果如下:1.体外建立了马BMSCs细胞系,检测BMSCs表达了干细胞标记因子Sox2及间充质干细胞表面标志因子CD44、CD90、CD105和整合素CD29。2.对分离纯化的BMSCs进行成软骨细胞的诱导分化,经14 d、21 d诱导培养后BMSCs成功分化为软骨细胞。分化细胞呈现了软骨细胞特有的形态,并表达了软骨细胞特异标记基因aggrecan、collagenⅡ和9。3.对BMSCs和由其分化而来的软骨细胞分别进行高通量转录组测序,所获数据经生物信息学相关软件分析,共鉴定出3592个lncRNA;BMSCs与分化软骨细胞之间差异表达lncRNA365个。筛选出多个参与调控马软骨细胞发育的潜在候选因子,如 lnc-cpm、lnc-traf3、lnc-22173、lnc-acvr2a、lnc-pde4d,其互作的靶基因分别为:MDM2、TRAF3、USP25、ACVR2A、PDE4d。经荧光定量 PCR 检测,BMSCs 和分化软骨细胞中这些差异lncRNA和mRNA的表达趋势与测序结果一致。4.经GO和KEGG分析,构建了差异表达的lncRNA与mRNA互作调控网络,发现这些靶标mRNA主要富集于Wnt信号通路、p53信号通路MAPK及NF-kb信号通路中,这些基因通过控制软骨细胞增殖、分化、凋亡,阻止破骨细胞生成,进而维持软骨细胞发育。其中Wnt信号通路的Wnt5a、Wntll、plcdl基因,MAPK信号通路的 MAPK20、MAP2K、MAPK7/8,P53 通路的 MDM2、Bcl-2、WAF1、SIRT1、NRF2基因及其lncRNA与软骨细胞的分化密切相关。以上研究结果为后续进一步揭示软骨细胞分化过程中lncRNAs与靶基因的互作机制奠定了必要的前期基础,为BMSCs用于软骨修复的细胞治疗提供了科学依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
•   1.1 间充质干细胞的概述
•   1.2 骨髓间充质干细胞的生物学特性
•   1.3 关节软骨研究进展
•     1.3.1 关节软骨的结构及功能
•     1.3.2 软骨细胞的生物学特性
•     1.3.3 软骨损伤,症状发生和修复
•     1.3.4 MSCs用于软骨损伤治疗的研究
•     1.3.5 软骨细胞分化调控机制
•   1.4 lncRNA研究进展
•     1.4.1 lncRNA的概述
•     1.4.2 lncRNA的作用机制
•     1.4.3 lncRNA在细胞分化的调控机制
•   1.5 研究目的、意义与内容
• 2 马BMSCs的建立及向软骨的诱导分化
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 实验仪器及耗材
•     2.1.3 实验试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 马BMSCs的原代培养
•     2.2.2 细胞的传代培养
•     2.2.3 细胞RNA的提取
•   2.3 马BMSCs向软骨细胞的诱导分化
•     2.3.1 材料与方法
•     2.3.2 实验方法
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 马BMSCs的鉴定
•     2.4.2 软骨细胞的诱导分化
•     2.4.3 软骨细胞的分化鉴定
•   2.5 讨论
•     2.5.1 诱导剂的添加选择
•     2.5.2 软骨细胞诱导分化的鉴定
•   2.6 小结
• 3 马BMSCs向软骨细胞诱导分化中差异表达lncRNA和mRNA的筛选
•   3.1 实验材料与方法
•     3.1.1 材料
•     3.1.2 实验仪器
•     3.1.3 主要试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 总RNA的提取
•     3.2.2 总RNA质量检测
•     3.2.3 lncRNA高通量测序
•     3.2.4 候选差异lncRNA、mRNA预测及验证
•     3.2.5 构建差异表达的lncRNA及mRNA互作网络
•   3.3 结果及分析
•     3.3.1 RNA质检结果
•     3.3.2 lncRNA测序长度分析
•     3.3.3 差异lncRNA和mRNA的表达
•     3.3.4 lncRNA在分化组和对照组间差异表达分析
•     3.3.5 mRNA在分化组和对照组差异表达分析
•   3.4 生物信息学分析及荧光定量PCR验证
•     3.4.1 lncRNA靶基因预测及功能分析
•     3.4.2 差异mRNA功能分析
•     3.4.3 荧光定量PCR验证
•   3.5 差异lncRNA靶基因预测
•   3.6 差异lncRNA及其靶基因功能富集分析
•   3.7 讨论
•     3.7.1 GO、KEGG富集分析
•     3.7.2 细胞凋亡信号通路
•     3.7.3 非经典Wnt信号对MAPK通路的影响
•   3.8 小结
• 4 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏奥

导师: 张焱如,刘春霞

关键词: 软骨细胞分化,互作

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: Q25

DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000432

总页数: 54

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