少孢节丛孢双敲除菌株的构建及对生物合成基因的功能研究

论文摘要

捕食线虫真菌少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）产生一类特有的可以调控菌丝形态的信号小分子-少孢素类化合物（Arthrosporols）。本课题组前期通过单基因敲除方法,鉴定了位于AOLs00215g基因簇上参与少孢素类化合物生物合成的9个关键基因283-276和基因274,但对其中的274、280、276、277、278这五个基因的生物合成功能仍未完全解析,本论文通过构建双敲除突变菌株来研究这些生物基因的功能。主要结果和创新:1、利用潮霉素和氯嘧磺隆为筛选标记,成功构建四株少孢节丛孢双基因敲除突变菌株Δ280A274、Δ278A277、Δ276A277、Δ259A911。2、双敲除菌株Δ280A274菌丝形态与单敲除菌株Δ280更相似,比单敲除菌株A274的菌丝更为茂盛;Δ280Δ274生长速度要比Δ280、Δ274、野生菌株分别慢28.0%、30.3%、30.7%。在24h,Δ280A274捕器数量比Δ280、A274、野生型菌株分别增加0.2倍、2.5倍、5.7倍。在孢子产量上,A280A274比野生型少98.9%,比A274少99.4%,但是比Δ280的增加2倍。基因280敲除比基因274敲除对菌丝形态、孢子产量、捕器数量影响更大,A280A274的菌丝形态、孢子产量、捕器数量更接近A280。3、双敲除菌株A259A911菌丝形态与单敲除菌株A259更相似,但生长速度比Δ259快6.7%,比单基因敲除菌株A911慢7.3%,比野生菌株慢l17.2%。在孢子产量上,Δ259Δ911比Δ259减少81.2%,比Δ911和野生型菌株均少99%以上。基因259敲除比基因911敲除对菌丝形态、孢子产量影响更大,A259A911的菌丝形态、孢子产量更接近Δ259。4、双敲除菌株A278A277的菌丝形态与单敲除菌株A278更相似,但是生长速度比A278快5.0%,比单基因敲除菌株A277慢5.6%,比野生型菌株慢7.3%;在孢子产量上,A278A277比A278减少57.4%,比A277和野生型菌株均减少约99%。敲除基因278比敲除基因277对菌丝形态、孢子产量影响更大,A278A277菌丝形态、孢子产量更接近Δ278。5、在PDA、TYGA、YMA培养基中,双基因敲除菌株Δ276Δ277生长速度比单基因敲除菌株A276慢7.8%,在PDA、TYGA培养基中,Δ276Δ277生长速度比Δ277快2.9%。在12h,A276A277捕器数量比A277增加30.0%,比A276增加4.3%,而此时野生型无成熟的三维菌网。在孢子产量上,A276A277比A276减少16.0%,比野生型菌株减少30.4%,但比Δ277增加17.7%。基因276、基因277敲除对菌丝生长、菌丝形态、孢子产量有不同程度的影响,因而Δ276A277菌丝生长、孢子产量介于A276和A277之间,菌丝形态与野生型相似。6、双敲除菌株Δ280A274发酵液粗提物的LC-MS的图谱,在保留时间35.98min出现了[M+H]+343.226310峰,这与少孢素生物合成的关键中间体三元环氧化合物的343.22632对应。同时A280A274与Δ274有4相同的特有峰分别是:275.163[M+H]+（19.34min）、313.20059[M+H]+（20.67min）、343.22638[M+H]+（35.92min）、327.23126[M+H]+（39.47min）,与A280有2 个相同的特有峰是243.08742[M+H]+（15.80min）、267.11878[M+H]+（18.38min）。基因259敲除以后代谢图谱变化很大,大量产物消失,与少孢素生物合成最上游基因283敲除后的变化相似,而菌株Δ911与野生型的代谢图谱一致,双敲除菌株Δ259Δ911的代谢图谱与Δ259与一致。双敲除菌株Δ277Δ278的代谢图谱与Δ277一致,且Δ277代谢图谱中没有出现含有C15的法尼基杂合小分子,而Δ278中显示出含有C15的法尼基杂合小分子,表明基因277作用在基因278前面。双敲除菌株Δ276Δ277的代谢图谱与Δ276一致,且Δ276代谢图谱中没有出现PKS-TPS杂合小分子,以及峰的消失比Δ277更多,表明在少孢素生物合成途径中基因276作用应在基因277前面。本实验中通过构建双敲除菌株研究功能相似或相关的两个基因之间对菌丝生长、菌丝形态、孢子产量、孢子萌发、捕器数量和捕食线虫能力方面。发现双基因敲除菌株在形态和孢子萌发、捕器数量和捕食线虫能力上更偏向于引起差异变化更大的单基因敲除菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 论文综述
• 第二章 少孢节丛孢中生物合成相关基因的敲除
•   一 目的基因的预测
•     1 预测和分析的方法
•     2 预测和分析的结果
•       2.1 所选基因的氨基酸序列分析以及系统发育树分析
• s00215g274的蛋白质序列的分析'>    2.1.1 基因AOL_s00215g274的蛋白质序列的分析
• s00215g280的蛋白质序列的分析'>    2.1.2 基因AOL_s00215g280的蛋白质序列的分析
• s00215g911的蛋白质序列的分析'>    2.1.3 基因AOL_s00215g911的蛋白质序列的分析
• s00215g259的蛋白质序列的分析'>    2.1.4 基因AOL_s00215g259的蛋白质序列的分析
• s00215g278的蛋白质序列的分析'>    2.1.5 基因AOL_s00215g278的蛋白质序列的分析
• s00215g277蛋白质序列的分析'>    2.1.6 基因AOL_s00215g277蛋白质序列的分析
• s00215g276的蛋白质序列的分析'>    2.1.7 基因AOL_s00215g276的蛋白质序列的分析
•   二 敲除载体的构建及敲除
•     1 实验材料和仪器
•       1.1实验所用培养基
•       1.2 供试菌株和所用质粒
•       1.3 主要试剂
•       1.4 主要仪器设备
•     2 实验方法
•       2.1 引物设计
•       2.2 敲除载体构建
•     2.2.1 质粒选择
•     2.2.2 片段扩增及纯化
•     2.2.3 上下游片段插入载体
•       2.3 原生质体制备和转化
•     2.3.1 原生质体替换原理
•     2.3.2 原生质体制备
•     2.3.3 原生质体转化
•       2.4 转化子PCR验证
•     3 实验结果
•       3.1 载体全长验证及转化子敲除验证
• 第三章 少孢节丛孢突变菌株的表型特征及代谢图谱分析
•   一 实验材料
•     1 供试菌株
•     2 仪器与设备
•     3 主要试剂和材料
•   二 实验方法
•     1 少孢节丛孢突变菌株与野生菌株生长速率的检测
•     2 少孢节丛孢突变菌株与野生菌株产孢量和孢子萌发率的检测
•     3 少孢节丛孢突变菌株和野生菌株捕食能力的检测
•     4 少孢节丛孢突变菌株和野生菌株的代谢产物的检测
•       4.1 高效液相色谱质谱（HPLC-MS）检测
•       4.2 气相色谱质谱（GC-MS）检测
•   三 实验结果与分析
•     1 突变菌株与野生菌株的表型比较和分析
•       1.1 双敲除突变菌株Δ280Δ274与单突变菌株及野生菌株表型特征
•     1.1.1 突变菌株与野生菌株生长速率和形态的比较
•     1.1.2 捕器生成及线虫捕食能力的比较
•     1.1.3 孢子产量及孢子萌发率的比较
•       1.2 突变菌株Δ259Δ911与单突变菌株及野生菌株表型特征
•     1.2.1 突变菌株与野生菌株生长速率和形态的比较
•     1.2.2 捕器生成及线虫捕食能力的比较
•     1.2.3 孢子产量及孢子萌发率的比较
•       1.3 突变菌株Δ278Δ277与单突变菌株及野生菌株表型特征
•     1.3.1 突变菌株与野生菌株生长速率和形态的比较
•     1.3.2 捕器生成及线虫捕食能力的比较
•     1.3.3 孢子产量及孢子萌发率的比较
•       1.4 突变菌株Δ276A277与单突变菌株及野生菌株表型特征
•     1.4.1 突变菌株与野生菌株生长速率和形态的比较
•     1.4.2 捕器生成及线虫捕食能力的比较
•     1.4.3 孢子产量及孢子萌发率的比较
•     2 突变菌株与野生菌株的LC-MS检测结果和分析
•       2.1 突变菌株Δ280Δ274与单突变菌株及野生菌株LC-MS检测结果与分析
•       2.2 突变菌株Δ259Δ911与单敲除突变菌株及野生菌株LC-MS检测结果与分析
•       2.3 突变菌株Δ278Δ277与单敲除突变菌株及野生菌株LC-MS检测结果与分析
•       2.4 突变菌株Δ276Δ277、Δ276、Δ277与野生菌株LC-MS检测结果与分析
•     3 突变菌株与野生菌株的GC-MS检测结果和分析
•       3.1 突变菌株Δ280Δ274与单突变菌株及野生菌株GC-MS检测结果与分析
•       3.2 突变菌株Δ259Δ911与单突变菌株及野生菌株GC-MS检测结果与分析
•   四 小结与讨论
•     1 突变菌株Δ280Δ274与单突变菌株及野生菌株差异总结
•     2 突变菌株Δ259Δ911与单突变菌株及野生菌株差异总结
•     3 突变菌株Δ278Δ277与单突变菌株及野生菌株差异总结
•     4 突变菌株Δ276Δ277与单突变菌株及野生菌株差异总结
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 欧霞

导师: 牛雪梅

关键词: 少孢节丛孢,双敲除,表型,代谢图谱

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 云南大学

分类号: Q933

总页数: 119

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