甲壳素酶的克隆表达与分子改造研究

论文摘要

几丁寡糖（chitooligosaccharides,CHOS）因其具有良好的水溶性、抗氧化性和抗菌性能,广泛应用于化妆品、医药、食品和农药等领域。甲壳素酶能水解甲壳素结构中的β-1,4糖苷键,生成CHOS。与传统的化学法降解甲壳素相比,酶法具有反应温和、产物纯度高、无环境污染等优点,目前已成为生产CHOS的重要方法。然而,野生菌产的甲壳素酶催化效率低限制了其生产和应用。本研究以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600作为表达宿主菌,选择来源于芽孢杆菌属Bacillus sp.DAU101的甲壳素酶基因（chisb）构建表达载体。通过对表达载体中表达元件进行优化,并利用分子对接、定点突变以及易错PCR等手段,提高了甲壳素酶Chisb的表达水平及催化效率,使催化合成的CHOS产量和底物转化率进一步提高;同时,探究了原始酶及其突变体的酶学性质。主要研究内容及结论如下:（1）构建了含有Bacillus sp.DAU101甲壳素酶编码基因chisb的重组表达质粒,并成功在B.subtilis WB600中实现了异源表达。（2）对表达载体pP43NMKchisb-sp-his中表达元件进行了优化。通过信号肽筛选、核糖体结合位点（RBS）优化、启动子替换以及N端融合短肽等手段,最终将甲壳素酶Chisb的酶活提高到58 U?mL-1。（3）对Chisb催化结构域中保守区域（DXDXE）的氨基酸进行定点突变,证实了D193、D195和E197位的氨基酸在Chisb催化结构域中的重要作用。利用同源模拟构建Chisb的三维蛋白结构模型,并使用Discovery Studio（DS）软件将几丁五糖（GlcNAc）5与Chisb进行分子对接。通过定点突变,筛选得到唯一的正向突变体F273W,比酶活达到249.62U?mg-1,比原始酶提高了1.45倍。为进一步提高Chisb的催化效率,采用易错PCR和高通量筛选技术对Chisb进行定向进化研究,最终获得了两个正向突变体（C43D和E336R）,其比酶活分别为264 U?mg-1和280 U?mg-1,是原始酶的1.53倍和1.62倍。（4）高效液相色谱分析水解产物为N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、几丁二糖（GlcNAc）2、几丁三糖（GlcNAc）3和几丁五糖（GlcNAc）5。突变体C43D、E336R和F273W催化生成的CHOS产量分别为2.06 g?L-1、2.53 g?L-1和2.02 g?L-1,相比对照分别提高了2.31倍、2.84倍和2.27倍;除此之外,底物转化率分别为68.7%、84.3%和67.3%,相比对照分别提高了39%、54.6%和37.6%。（5）对酶学性质进行研究,确定了原始酶的最适温度为60oC,最适pH为5.0;突变体C43D和E336R的最适温度为55oC,F273W为60oC;C43D和F273W的最适pH为5.0,E336R为9.0。原始酶对胶体甲壳素和不同聚合度的CHOS亲和力较强;且向反应体系中添加Mn2+可以显著提高原始酶及其突变体的酶活;对原始酶及其突变体的动力学参数进行测定发现,相比原始酶,突变体的底物亲和力和催化效率都显著提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 几丁寡糖概述
•     1.1.1 几丁寡糖
•     1.1.2 CHOS的合成方法
•   1.2 甲壳素酶研究概述
•     1.2.1 甲壳素酶的来源、分类和结构
•     1.2.2 甲壳素酶研究历史和现状
•     1.2.3 甲壳素酶的应用
•   1.3 枯草芽孢杆菌作为表达宿主的优点
•   1.4 立题依据及研究意义
•   1.5 研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 培养基
•     2.1.5 流动相和主要溶液的配置
•   2.2 分子生物学操作方法
•     2.2.1 质粒DNA提取
•     2.2.2 聚合酶链式反应（PCR）体系和条件
•     2.2.3 DNA凝胶电泳
•     2.2.4 DNA片段的回收
•     2.2.5 一步克隆连接反应体系及条件
•     2.2.6 E.coli JM109 感受态的制备及转化方法
•     2.2.7 B.subtilis WB600 感受态制备及其转化方法
•     2.2.8 菌落PCR及其阳性转化子验证
•   2.3 分析检测方法
•     2.3.1 SDS-PAGE分析
•     2.3.2 甲壳素酶酶活检测方法[35]
•     2.3.3 甲壳素酶酶活标准曲线的制作
•     2.3.4 蛋白浓度的测定
•     2.3.5 高效液相色谱（HPLC）与离子色谱（IC）分析
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 重组菌株的培养
•     2.4.2 胶体甲壳素的制备方法
•     2.4.3 甲壳素酶基因筛选与表达载体的构建
• chisb-sp和 pP43NMK_chisb-sp-his的构建'>    2.4.4 表达质粒pP43NMK_chisb-sp和 pP43NMK_chisb-sp-his的构建
•     2.4.5 甲壳素酶Chisb分泌表达信号肽的筛选
•     2.4.6 含有不同核糖体结合位点（RBS）的表达质粒构建
•     2.4.7 含有不同启动子的表达质粒构建
•     2.4.8 甲壳素酶Chisb的 N端改造
•     2.4.9 甲壳素酶Chisb的蛋白结构模型预测与分子对接
•     2.4.10 定点突变与易错PCR引入随机突变方法
•     2.4.11 原始酶及其突变体的分离纯化
•     2.4.12 原始酶及其突变体的酶学性质研究
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 不同来源甲壳素酶基因的克隆与表达
•     3.1.1 甲壳素酶来源的选择
•     3.1.2 重组菌株的构建与表达效果
•   3.2 甲壳素酶基因chisb表达载体中表达元件的优化
•     3.2.1 不同信号肽对Chisb胞外分泌的影响
•     3.2.2 不同翻译强度的RBS对 Chisb表达量的影响
•     3.2.3 不同转录时期的启动子对Chisb表达的影响
•     3.2.4 不同N端融合序列对Chisb表达量的影响
•   3.3 半理性与非理性设计相结合提高Chisb的催化效率
•     3.3.1 甲壳素酶Chisb的三维结构同源建模与分子对接结果
•     3.3.2 突变位点的选择与突变体筛选
•     3.3.3 易错PCR与高通量技术结合筛选正向突变体
•     3.3.4 复合突变体的构建及其催化效果
•   3.4 催化产物的分析
•     3.4.1 CHOS检测的IC法与HPLC法比较
•     3.4.2 不同催化时间下的CHOS含量
•   3.5 原始酶及其突变体的纯化与酶学性质研究
•     3.5.1 原始酶及其突变体的纯化
•     3.5.2 温度和pH对原始酶及其突变体活性的影响
•     3.5.3 原始酶及其突变体的温度和pH稳定性研究
•     3.5.4 金属离子对原始酶及其突变体活性的影响
•     3.5.5 Chisb的底物特异性研究
•     3.5.6 原始酶及其突变体的动力学参数测定
• 主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 潘梦妍

导师: 刘龙

关键词: 甲壳素酶,几丁寡糖,表达元件,定点突变,易错,酶学性质

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

分类号: Q78

总页数: 66

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