Group2流感病毒中和抗体的制备和特征性结构的发现及功能分析

论文摘要

流行性感冒（Influenza）是流感病毒导致的强传染性疾病,一直是人类健康的重大威胁,对人类社会造成重大经济损失。世界范围内每年约有5%-15%的人口受季节性流感病毒感染,其中有25-50万人死亡。由于小分子药物及季节疫苗的局限性,寻求新的治疗及预防手段迫在眉睫。已报道的流感抗体的识别表位主要分为三种。类型一是以FI6v3,CR6261,F10,CR9114以及39.29等为代表,识别表位位于血球凝集素（HA）的融合亚结构域,包括HA1 N端和C端构成的上部和左侧,HA2 Helix A构成右侧,HA2融合肽C端构成下部。CR6261,F10只能中和Group1的流感病毒,而FI6v3,39.29及CR9114却既能中和Group1又能中和Group2的流感病毒。类型二以CR8020为代表,识别表位更加接近于HA的膜结合部位,包括Helix A序列前的βsheet及HA2上的融合肽,只能中和Group2的流感病毒。除此之外,类型三兼具以上两种类型抗体的识别表位,以MEDI8852及本实验室早期研发的3E1为代表。MEDI8852被报道能广谱性的中和Group1和Group2的流感病毒,3E1却只能中和Group1的流感病毒,但是在我们的研究中却发现MEDI8852不能结合个别H3N2 HA,这意味着针对H3N2更加广谱的、中和效果更好的流感抗体依然是未来重要的研究方向。除此之外,我们未能通过以上研究数据明确区分Group1及Group2流感病毒的识别表位的异同,即是否针对Group1及Group2流感病毒的抗体分别具有特各自特征性的识别表位?鉴于现有流感疫苗的短板,科学家们正努力研发广谱流感疫苗,因此新的抗体识别表位的发现也是重要的研究方向,将为广谱流感疫苗的设计提供新思路。为进一步阐述上述问题,我们启动本课题以研发一株Group2广谱流感抗体并寻找特征性识别表位。在本课题中,我们利用单细胞RT-PCR技术,从一名接种过三价季节性流感疫苗的志愿者体内成功分离一株Group2广谱中和抗体,12mAb。12mAb对全部Group2（H3/H4/H7/H10/H14/H15）亚型毒株HA具有较高亲和力,能广谱中和H3,H4及H7亚型的流感病毒。小鼠水平上的实验也证实12mAb对H3N2亚型流感病毒具有预防和治疗效果。机制研究表明12mAb是通过抑制低pH值诱导的HA的构象变化,进一步抑制宿主胞膜与病毒包膜的融合,从而抑制病毒入侵宿主细胞。为了从结构上探索抗原抗体的相互作用模式,我们通过冷冻电镜技术对12mAb Fab-H3N2 HA复合物进行结构解析。冷冻电镜结果显示,12mAb Fab的识别表位非常特殊,主要靶定于H3N2 HA的茎秆部区,包括Helix A的C端少数氨基酸,Helix A与Helix B之间的loop N端氨基酸序列及其附近的HA1上的部分氨基酸。目前,未曾报道有靶定到该表位的流感抗体。12mAb的CDR区深入到以上表位形成的沟槽中,我们认为这种结合方式更加紧密,预示着12mAb对H3N2 HA具有更高的亲和力。通过比较12mAb和已报道的广谱性及中和活性最好的流感病毒抗体MEDI8852,我们发现12mAb对不同年代流行的H3N2亚型流感病毒的结合及中和活性都要优于MEDI8852,尤其对近几年流行的H3N2流感病毒HA具有更好的结合活性,这与前期所述冷冻电镜结构数据比较一致。这为解决近几年频频爆发流行的H3N2病毒提供新的、更优的防控手段。冷冻电镜结构表明12mAb结合H3N2 HA的表位中包括Helix A与Helix B之间的loop区的N端氨基酸序列,该段序列在HA上是一段线性化序列。ELISA及Western Blot实验进一步证实此段序列的存在。结果表明,12mAb能结合线性化的H3N2 HA蛋白,而MEDI8852,CR8020等抗体均不能结合线性化的HA蛋白,表明12mAb识别H3N2 HA蛋白的一段线性表位,而其它抗体均是构象表位。这揭示出12mAb的与众不同。同时,我们通过截短表达实验找到12mAb结合H3N2 HA蛋白的主要序列,即H3N2 HA2 58-75位氨基酸。我们意外发现12mAb也能中和Group1的H1N1流感病毒。12mAb Fab主要靶定于H1N1 HA的Helix A上,这与FI6v3,CR6261等抗体的表位较为类似,却显著异于12mAb Fab对H3N2 HA的识别表位。目前未曾有流感抗体被报道在不同亚型HA的识别表位差异巨大,这代表一类新的抗体抗原相互作用模式。通过对12mAb的研究,我们明确了一个Group2异于Group1的识别表位。新的表位的发掘为流感疫苗的设计提供新的靶点与思路,同时提示我们广谱流感疫苗的设计不应只考虑所有亚型中HA的保守序列,还应考虑不同亚型HA的差异序列。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 引言
•   1.1 流感病毒简介
•     1.1.1 流行性感冒简介
•     1.1.2 流感病毒的基本结构及分类
•     1.1.3 流感病毒的生活史
•     1.1.4 流感病毒的抗原漂变及抗原转变
•     1.1.5 流感病毒表面糖蛋白血凝素的结构及变构
•   1.2 目前预防和治疗流感的主要策略
•     1.2.1 流感病毒疫苗的研发状况及利弊
•     1.2.2 流感病毒小分子药物的研发状况及利弊
•   1.3 流感病毒广谱中和抗体的研究进展及发展趋势
•     1.3.1 流感病毒广谱中和抗体的主要研究进展
•     1.3.2 已经在进行临床试验的流感病毒抗体药物
•   1.4 流感病毒广谱中和抗体的应用价值及未来研究方向
• 第2章 实验材料及实验方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 疫苗
•     2.1.3 伦理
•     2.1.4 质粒、菌株及细胞
•     2.1.5 抗体及蛋白
•     2.1.6 流感病毒
•     2.1.7 试剂耗材
•     2.1.8 基因序列
•     2.1.9 实验所用溶液
•     2.1.10 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 特异性记忆B细胞的获得
•     2.2.2 抗体表达与纯化
•     2.2.3 ELISA检测抗体结合抗原的活性
•     2.2.4 抗体亲和力（KD值）检测
• 50测定'>    2.2.5 病毒TCID₅₀测定
•     2.2.6 病毒微中和实验
•     2.2.7 动物实验
•     2.2.8 抗体抑制HA0 酶切实验
•     2.2.9 抗体抑制HA构象变化实验
•     2.2.10 抗体抑制膜融合实验
•     2.2.11 HA蛋白变性实验
•     2.2.12 三聚体HA蛋白的表达与纯化
•     2.2.13 凝胶过滤层析纯化蛋白
•     2.2.14 12mAb Fab-HA复合物制备
•     2.2.15 冷冻样品的制备、数据收集、单颗粒法三维重构及抗体同源建模
•     2.2.16 统计分析
• 第3章 实验结果
•   3.1 12 mAb的发现与制备
•     3.1.1 志愿者血清学检测
•     3.1.2 12 mAb的研发流程
•     3.1.3 小结
•   3.2 12 mAb的基本特征
•     3.2.1 12 mAb的胚系基因信息总结
•     3.2.2 体细胞突变对12mAb的亲和力的影响
•     3.2.3 小结
•   3.3 体外实验证实12mAb可以广谱性的中和Group2 的流感病毒
•     3.3.1 12 mAb的体外结合活性及中和活性检测
•     3.3.2 小结
•   3.4 体内实验证实12mAb对 H3N2 流感病毒表现出很好的保护作用
•     3.4.1 12 mAb对 H3N2 流感病毒的预防效果检测
•     3.4.2 12 mAb对 H3N2 流感病毒的治疗效果检测
•     3.4.3 小结
•   3.5 12 mAb通过抑制HA蛋白的构象变化从而抑制病毒入侵宿主细胞
•     3.5.1 12 mAb不能抑制流感病毒HA与宿主细胞表面唾液酸受体的结合
•     3.5.2 12 mAb能抑制低pH诱导的病毒包膜与宿主胞膜的膜融合
•     3.5.3 12 mAb能抑制HA0 的酶切及低pH值诱导的HA的构象变化
•     3.5.4 小结
•   3.6 12 mAb Fab-H3N2 HA复合物的冷冻电镜结构解析
•     3.6.1 12 mAb Fab-HA复合物制备
•     3.6.2 12 mAb Fab-H3N2 HA复合物的整体三维结构重构
•     3.6.3 12 mAb相对于其它抗体的识别表位及作用方式更加独特
•     3.6.4 小结
•   3.7 12 mAb对 H3N2 流感病毒的结合及中和活性要优于MEDI
•     3.7.1 12 mAb与 MEDI8852 对多株H3N2 流感病毒的结合活性检测
•     3.7.2 12 mAb与 MEDI8852 对多株H3N2 流感病毒的中和活性检测
•     3.7.3 小结
•   3.8 12 mAb在 H3N2 HA的识别表位中包括一段线性序列
•     3.8.1 12 mAb对线性的H3N2 HA依然具有很高的结合活性
•     3.8.2 HA截短实验找到这段线性序列大约位于HA2的58-75 位氨基酸
•     3.8.3 小结
•   3.9 体内外实验发现12mAb对 H1N1 流感病毒也有中和活性
•     3.9.1 12 mAb对 H1N1 流感病毒的结合活性及中和活性检测
•     3.9.2 12 mAb对 H1N1 流感病毒的体内预防及治疗效果检测
•     3.9.3 12 mAb抑制H1N1 流感病毒感染的作用机制
•     3.9.4 12 mAb不能结合线性化的H1N1 HA蛋白
•     3.9.5 小结
•   3.10 12 mAb Fab-H1N1 HA复合物的冷冻电镜结构解析
•     3.10.1 12 mAb Fab-H1N1 HA复合物制备
•     3.10.2 12 mAb Fab-H1N1 HA复合物的整体三维结构重构
•     3.10.3 12 mAb Fab在 H3N2 HA及 H1N1 HA中的识别表位不同
•     3.10.4 小结
• 第4章 结论与讨论
•   4.1 本课题的主要结论
•   4.2 本课题的研究意义
• 第5章 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文及研究成果
• 专业综述
•   参考文献

文章来源

类型: 博士论文

作者: 孙晓玉

导师: 孙兵

关键词: 流感病毒,广谱中和抗体,冷冻电镜,血凝素蛋白,抗原表位

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

分类号: R392

DOI: 10.27915/d.cnki.gkbsd.2019.000013

总页数: 112

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