辽宁地区两株FAdV-4分离鉴定及Penton、Fiber1和Fiber2基因遗传进化分析

论文摘要

禽腺病毒I群血清4型（FAdV-4）引起的以心包积液和肝炎为主要特征的禽病毒性传染病,通常称为心包积液-肝炎综合征。该病早期报道是在1987年的巴基斯坦的安卡拉地区,所以通常被称为禽安卡拉病。1989年后该病在世界范围内流行,2015年在我国大面积暴发。该病发病迅速、传播快,易感染3-5周龄的肉鸡,死亡率在20%-80%之间。为了解目前禽安卡拉病的分子流行情况,探究辽宁省FAdV-4变异趋势,本实验室将疑似感染禽安卡拉病病料进行分离鉴定和Penton、Fiber1、Fiber2基因克隆及遗传进化分析,具体试验结果如下:1.设计FAdV-4六邻体基因片段的特异性引物,PCR扩增病鸡肝脏DNA,结果均在954 bp片段出现明亮的目的条带。将结果和公开基因库中分离株进行对比,同源性达到99.9%,确定为FAdV-4病毒感染。2.接种9日龄SPF鸡胚,尿囊液不对1%公鸡红细胞产生凝集;以尿囊液DNA为模板,PCR鉴定出目的条带,说明该病毒增殖成功;透射电镜观察,可见该病毒为直径70-80 nm无囊膜的球形粒子,呈二十面体典型的禽腺病毒结构,表明禽腺病毒分离成功。3.以分离后的病毒液DNA为模板,PCR扩增Penton、Fiber1、Fiber2基因,两株毒株均在1578 bp、1296 bp、1440 bp片段处出现目的条带。克隆测序后与国内外参考毒株比对分析结果:两株毒株的Penton、Fiber1、Fiber2基因核苷酸序列与国内参考毒株同源性分别为99.9%-100%、99.8%-100%和100%,而与国外的各国家的参考毒株的同源性分别为98.8%-99.2%、96%-97.1%和95.8%-97.2%。其中,鞍山株Penton基因核苷酸序列在第1078位由T变为C为错义突变,其氨基酸序列第360位由色氨酸变为精氨酸。鞍山株Fiber1基因核苷酸序列在第540位由A变为T,为同义突变。通过系统发育树可以看到两株毒株的三个基因均与国内分离株在同一分支内。与国外分离株不在同一分支。4.抗原表位分析预测:13-24、66-79、91-100、160-171、217-228、286-291、359-375、402-409和498-504片段可能是Penton蛋白潜在的抗原优势表位;15-50、100-104、306-310、315-319、328-335、400-404和423-427片段可能是Fiber1蛋白潜在的抗原优势表位;4-19、27-33、241-247和258-262片段可能是Fiber2蛋白潜在的抗原优势表位,鞍山株Penton蛋白在第360位发生氨基酸位点变异,该位点处于潜在的抗原优势表位区域中,这是否对该分离株的免疫原性和致病性产生影响还有待进一步研究。综上所述,辽宁地区两株分离株的Penton、Fiber1、Fiber2基因遗传进化分析,为目前我省禽安卡拉病的分子流行情况提供了基础数据,同时也为进一步研究分离株的致病性、毒力和I群禽腺病毒疫苗研发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 腺病毒的病原学
•     1.1.1 腺病毒的分类
•     1.1.2 禽腺病毒的基本结构
•     1.1.3 禽腺病毒的蛋白及功能
•     1.1.4 禽腺病毒的特性
•   1.2 禽腺病毒感染的流行病学
•   1.3 禽腺病毒感染的临床症状及病理变化
•   1.4 禽腺病毒感染的诊断技术
•     1.4.1 病毒的分离鉴定
•     1.4.2 血清学诊断
•     1.4.3 分子生物学诊断
•   1.5 试验目的与意义
• 第二章 FAdV-4 的分离鉴定
•   2.1 主要材料与试剂
•     2.1.1 主要仪器及厂家
•     2.1.2 主要试剂及厂家
•     2.1.3 主要溶液的配制
•     2.1.4 试验动物及病料来源
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 FAdV-4 的鉴定
•     2.2.2 FAdV-4 的分离
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 组织DNA为模板的PCR扩增及测序结果
•     2.3.2 SPF鸡胚试验结果
•     2.3.3 尿囊液DNA为模板的PCR扩增结果
•     2.3.4 血凝试验结果
•     2.3.5 病毒粒子电镜观察
•   2.4 讨论
•     2.4.1 近几年安卡拉病在我国的流行情况
•     2.4.2 病毒的增殖方式
•     2.4.3 病毒的分离方法
•   2.5 小结
• 第三章 FAdV-4 Penton、Fiber1、Fiber2 基因的克隆及遗传进化分析
•   3.1 主要材料及试剂
•     3.1.1 主要仪器及厂家
•     3.1.2 主要试剂及厂家
•     3.1.3 主要溶液的配制
•     3.1.4 试验病料来源
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 Penton、Fiber1、Fiber2 基因的PCR扩增
•     3.2.2 重组质粒的构建及鉴定
•     3.2.3 Penton、Fiber1、Fiber2 基因序列比对
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 Penton、Fiber1、Fiber2 基因PCR扩增结果
•     3.3.2 重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定结果
•     3.3.3 Penton、Fiber1、Fiber2 基因序列分析结果
•   3.4 讨论
•     3.4.1 遗传进化分析
•     3.4.2 抗原表位的预测
•   3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王晓语

导师: 吴长德,张宏

关键词: 禽腺病毒,基因,纤突蛋白,遗传进化,抗原表位

来源: 沈阳农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 沈阳农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000401

总页数: 61

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