EGF诱导人胚肺成纤维细胞衰老的机制研究

论文摘要

研究背景与目的:细胞衰老是细胞发生不可逆的生长停滞的现象。衰老细胞具有一系列的特征,如β-半乳糖苷酶活性升高、DNA损伤累积、衰老相关的异染色质凝集点（SAHF）增加及衰老相关蛋白的表达增加等。表皮生长因子EGF是一个重要的有丝分裂原,目前大多数的研究表明EGF能够抑制细胞衰老、延长细胞寿命,仅有少数研究提出EGF能够抑制细胞生长、诱导细胞衰老或凋亡,但其中的机制尚未被阐明。本研究发现EGF能够诱导人胚肺成纤维细胞IMR90发生衰老,所以本课题主要对EGF诱导IMR90细胞衰老的机制进行了探究。研究方法与结果:在本研究中,我们发现EGF能够诱导IMR90细胞发生衰老。首先,细胞生长曲线和Brd U掺入实验证明了EGF处理抑制了IMR90细胞的生长。通过观察,发现经EGF处理的细胞呈现出衰老细胞的表征,SA-β-gal染色和DAPI染色的结果表明EGF诱导IMR90细胞发生了衰老。在此基础上,免疫荧光和免疫印迹技术的检测结果显示,53BP1凝集点形成,γH2A.X和53BP1蛋白水平上调,表明EGF处理引发了DNA损伤反应;p38、p-p38、p53、p-p53、p21和p16蛋白水平上调,表明EGF激活了衰老相关信号通路。在探究EGF诱导IMR90细胞衰老的机制的过程中,Ras-GTP assay和免疫印迹的结果表明EGF刺激之后,细胞内的Ras-GTP、p-ERK1/2蛋白水平上调,EGF激活了细胞内的Ras信号通路;利用慢病毒敲减BRaf抑制了EGF引起的细胞衰老。因此,推测EGF是通过激活Ras-Raf-MEK-ERK通路诱导IMR90细胞发生衰老的。此外,我们还发现EGF诱导IMR90细胞衰老与细胞周期相关,处于G2/M期的细胞更容易被EGF诱导发生衰老。研究结论与意义:综合以上研究内容,我们发现EGF通过激活EGFR下游的Ras信号通路,引起细胞内DNA损伤反应和衰老相关信号通路的激活,导致IMR90细胞的衰老。这些研究成果丰富了人们对EGF生物学功能的认知,有助于推动EGF诱导细胞衰老的机制的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 细胞衰老
•     1.1.1 细胞衰老的类型及诱发因素
•     1.1.2 衰老细胞的基本特征
•       1.1.2.1 细胞增殖阻滞
•       1.1.2.2 衰老相关的β-半乳糖苷酶
•       1.1.2.3 DNA损伤位点
•       1.1.2.4 衰老相关异染色质凝集点
•       1.1.2.5 衰老相关的分泌表型
•     1.1.3 衰老相关信号通路
• Cip/Waf1通路'>      1.1.3.1 p53-p21^Cip/Waf1通路
• INK4A-Rb通路'>      1.1.3.2 p16^INK4A-Rb通路
•     1.1.4 细胞衰老是重要的肿瘤预防屏障
•   1.2 EGF与EGFR
•     1.2.1 EGF简介
•     1.2.2 EGFR简介
•     1.2.3 EGFR下游的信号通路
•       1.2.3.1 Ras-Raf-MEK-ERK通路
•       1.2.3.2 PI3K-Akt通路
•   1.3 EGF与细胞衰老
•   1.4 本课题的研究内容和意义
• 第二章 EGF诱导IMR90细胞发生衰老
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验细胞
•     2.1.2 实验仪器
•     2.1.3 实验试剂与材料
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 试剂配制
•     2.2.2 细胞培养
•       2.2.2.1 细胞复苏
•       2.2.2.2 细胞传代
•       2.2.2.3 种细胞
•       2.2.2.4 细胞冻存
•     2.2.3 EGF处理细胞
•     2.2.4 细胞生长曲线的测定
•     2.2.5 BrdU掺入实验
•       2.2.5.1 种片
•       2.2.5.2 BrdU掺入实验
•     2.2.6 衰老相关表型的鉴定
•       2.2.6.1 SA-β-gal染色
•       2.2.6.2 DAPI染色
•     2.2.7 细胞凋亡的检测
•     2.2.8 数据统计学分析
•   2.3 实验结果与分析
•     2.3.1 EGF抑制IMR90细胞增殖
•     2.3.2 EGF通过诱导IMR90细胞衰老抑制其生长
•       2.3.2.1 EGF诱导IMR90细胞发生衰老
•       2.3.2.2 EGF不能诱导IMR90细胞发生凋亡
•   2.4 小结与讨论
• 第三章 EGF激活IMR90细胞内衰老相关信号通路
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验细胞
•     3.1.2 实验仪器
•     3.1.3 实验试剂与材料
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 试剂配制
•     3.2.2 细胞的收集
•     3.2.3 细胞总蛋白的提取与浓度测定
•     3.2.4 蛋白免疫印迹
•     3.2.5 免疫荧光
•   3.3 实验结果与分析
•     3.3.1 EGF引发IMR90细胞内的DNA损伤反应
•     3.3.2 EGF激活IMR90细胞内衰老相关信号通路
•       3.3.2.1 EGF激活p53-p21信号通路
•       3.3.2.2 EGF激活p38 MAPK-p16信号通路
•   3.4 小结与讨论
• 第四章 EGF激活Ras-ERK通路诱导IMR90细胞衰老
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验细胞及菌株
•     4.1.2 实验仪器
•     4.1.3 实验试剂与材料
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 试剂配制
•     4.2.2 活化的Ras的检测
•     4.2.3 pLKO.1-BRaf shRNA慢病毒表达载体构建
•       4.2.3.1 寡核苷酸链的设计
•       4.2.3.2 退火
•       4.2.3.3 载体的酶切及胶回收
•       4.2.2.4 酶切后载体与寡核苷酸链的连接反应
•       4.2.2.5 转化
•       4.2.2.6 质粒的提取
•       4.2.2.7 测序验证
•     4.2.4 制备BRaf敲减的IMR90细胞
•       4.2.4.1 慢病毒的制备
•       4.2.4.2 病毒感染细胞
•   4.3 实验结果与分析
•     4.3.1 EGF激活Ras-ERK通路
•     4.3.2 BRaf的敲减抑制EGF诱导的细胞衰老
•       4.3.2.1 重组载体pLKO.1-TRC-shBRaf的构建及BRaf敲减效果的验证
•       4.3.2.2 BRaf的敲减抑制了EGF引起的细胞增殖能力的减弱
•       4.3.2.3 BRaf的敲减抑制了EGF引起的β-gal活性的增强及SAHF的形成
•       4.3.2.4 BRaf的敲减抑制了EGF诱导的DNA损伤的积累和衰老相关蛋白的表达
•   4.4 小结与讨论
• 第五章 EGF特异性地诱导处于G2/M期的细胞发生衰老
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 实验细胞
•     5.1.2 实验仪器
•     5.1.3 实验试剂
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 试剂配制
•     5.2.2 EGF短时间刺激IMR90细胞
•     5.2.3 EGF多次短时间刺激IMR90细胞
•     5.2.4 胸苷双阻断法实现S期同步化
•     5.2.5 流式细胞术检测细胞周期
•   5.3 实验结果与分析
•     5.3.1 EGF短时间刺激引起IMR90细胞衰老
•     5.3.2 多次EGF短时间刺激增加衰老细胞的数量
• 2/M期的细胞发生衰老'>    5.3.3 EGF特异性地诱导G₂/M期的细胞发生衰老
•       5.3.3.1 胸苷双阻断法实现细胞周期同步化
• 2/M期的细胞发生衰老'>      5.3.3.2 EGF特异性地诱导G₂/M期的细胞发生衰老
•   5.4 小结与讨论
• 第六章 总结与展望
•   6.1 工作总结
•   6.2 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 沈明香

导师: 屠志刚

关键词: 细胞衰老,表皮生长因子,通路

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 江苏大学

分类号: R329.2

总页数: 79

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