转紫茉莉基因MirXTH和edMAN拟南芥植株的筛选和鉴定

论文摘要

石油污染土壤的微生物-植物联合修复系统的建立及互作修复机制成为本领域的研究热点,其中植物的耐污染能力成为该系统建立成败的限制因素之一。细胞壁既是感知外界胁迫信号的第一个细胞结构,更是抵御外界胁迫保护植物细胞的第一层防御系统,所以本课题组以根系较为发达且在中低浓度石油污染耐受的紫茉莉为试验材料,以根部参与细胞壁的重构和重排、松弛性以及延展性起调节作用的两个蛋白基因:MirXTH和edMAN为研究对象,开展紫茉莉根部对土壤中石油污染胁迫的应激反应分子机制研究,进而更深层次的揭示石油污染条件下紫茉莉在分子水平上的耐受机制。本试验研究结果如下:1.将MirXTH以及edMAN通过农杆菌介导花絮浸染的方法转化到野生型拟南芥中,利用潮霉素筛选、PCR技术对转基因植株进行初步的鉴定,鉴定得到20株含有edMAN的阳性转基因植株,5株含有MirXTH的阳性转基因植株。2.利用丙酮法提取紫茉莉、野生型拟南芥以及纯合的含有MirXTH和edMAN的转基因植株的蛋白质,以紫茉莉为阳性对照,野生型拟南芥为阴性对照,通过Western blot试验鉴定得到:外源基因edMAN成功翻译表达、并得到13株纯合的edMAN转基因株系,外源基因MirXTH成功翻译表达、并得到3株纯合的MirXTH转基因株系。3.以野生型拟南芥为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术,分别对纯合的转基因植株中MirXTH和edMAN进行表达量的分析,数据结果显示MirXTH和edMAN在拟南芥中均过表达。4.分别选择转edMAN、MirXTH拟南芥株系表达量相对较高及较低的株系进行表型观察。表型观察发现:edMAN转基因植株的侧根个数明显增多、主根长度明显增长、莲座叶叶片数量增多、抽苔数量增多,MirXTH转基因植株的侧根个数明显增多、主根长度明显增长。根据选取的转基因植株株系进行表型观察发现紫茉莉MirXTH和edMAN促进根部以及叶片的伸长、生长,进一步明确了紫茉莉中MirXTH和edMAN的功能,为研究紫茉莉在修复石油污染中根部细胞壁的分子机制打下夯实的基础,为揭示石油污染条件下紫茉莉在分子水平上的耐受机制做铺垫。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 植物细胞壁研究进展
•   1.2 细胞壁松弛因子
•     1.2.1 木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（XTHs）
•     1.2.2 XTHs的研究进展
•   1.3 β-甘露聚糖酶（β-mannanase）
•     1.3.1 β-甘露聚糖酶
•     1.3.2 β-甘露聚糖酶的研究进展
•   1.4 基因功能研究
•     1.4.1 转基因
•     1.4.2 基因突变
•     1.4.3 基因敲除
•   1.5 蛋白免疫印迹
•   1.6 实时荧光定量PCR
•     1.6.1 qRT-PCR内参基因的选择
•     1.6.2 不同领域中内参基因的选择
•   1.7 目的与意义
• 第二章 拟南芥的转化与转基因纯合株系的筛选
•   2.1 试验材料、试剂及试验仪器
•     2.1.1 试验材料
•     2.1.2 试验试剂
•     2.1.3 试验仪器
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 农杆菌浸染拟南芥
•     2.2.2 拟南芥转基因植株的筛选
•     2.2.3 拟南芥转基因植株的初步鉴定
•     2.2.4 拟南芥转基因纯合株系的筛选
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 拟南芥转基因植株的筛选
•     2.3.2 拟南芥转基因植株DNA提取
•     2.3.3 拟南芥转基因植株PCR鉴定
•     2.3.4 拟南芥转基因纯合植株筛选
•   2.4 小结
• 第三章 转基因拟南芥蛋白表达水平的鉴定
•   3.1 试验材料、试剂及试验仪器
•     3.1.1 试验材料
•     3.1.2 试验试剂
•     3.1.3 试验仪器
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 转基因拟南芥叶片总蛋白的提取
•     3.2.2 蛋白定量
•     3.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
•     3.2.4 Western blot
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 蛋白质定量结果
•     3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
•     3.3.3 Western blot验证
•   3.4 小结
• 第四章 转基因拟南芥edMAN和 Mir XTH的表达分析
•   4.1 试验材料、试剂及试验仪器
•     4.1.1 试验材料
•     4.1.2 试验试剂
•     4.1.3 试验仪器
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 拟南芥叶片中总RNA的提取
•     4.2.2 反转录
•     4.2.3 实时荧光定量
•   4.3 结果与分析
•   4.4 小结
• 第五章 转edMAN和 MirXTH拟南芥植株的表型观察
•   5.1 试验材料、试剂及试验仪器
•     5.1.1 试验材料
•     5.1.2 试验试剂
•     5.1.3 试验仪器
•   5.2 试验方法
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 转基因植株根部表型观察
•     5.3.2 转基因植株根部主根长度以及侧根个数数据统计
•     5.3.3 转基因植株表型观察
•     5.3.4 转基因植株抽苔数量以及莲座叶数量统计
•   5.4 小结
• 第六章 讨论与结论
•   6.1 讨论
•   6.2 结论
•     6.2.1 edMAN和 MirXTH转入野生型拟南芥
•     6.2.2 edMAN和 MirXTH成功翻译表达
•     6.2.3 edMAN和 MirXTH的相对表达量呈上调趋势
•     6.2.4 转基因拟南芥生长状态好于野生型拟南芥
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术文章

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王奡

导师: 马慧

关键词: 细胞壁松弛,转基因株系筛选

来源: 沈阳农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用

单位: 沈阳农业大学

分类号: X173;Q943.2

DOI: 10.27327/d.cnki.gshnu.2019.000164

总页数: 60

文件大小: 1979K

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