表达禽腺病毒Fiber2基因重组新城疫病毒的拯救及免疫效果评价

论文摘要

自2015年以来,国内鸡群因禽腺病毒（Fowl adenoviruses,FAdV）感染引起的鸡肝炎-心包积液综合征（Hepatitis and Hydropericardium Syndrome,HHS）的病例呈逐年上升趋势。HHS主要多发于3～5周龄肉鸡,偶尔在10～20周龄蛋鸡中出现,给国内养禽业造成了严重的经济损失。流行病学调查显示,国内鸡群中FAdV的流行毒株主要是高致病性血清4型禽腺病毒（FAdV-4）。国外市场虽然已有部分商品化的FAdV灭活疫苗和弱毒活疫苗,但价格昂贵,难以在国内推广。目前,国内己有多项与FAdV-4相关的疫苗专利申请成功,包括各种灭活苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗,但尚没有针对FAdV-4的商品化疫苗。本研究首先通过反向遗传学操作以改造后致弱的基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）毒株（MG7）为载体（其F蛋白裂解位点从原碱基序列突变为LaSota疫苗株F蛋白的裂解位点）,构建表达FAdV-4 Fiber2抗原基因的重组质粒并进行病毒拯救。接着通过检测鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄SPF雏鸡颅内接种致病指数（ICPI）和6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）、鸡胚传代毒株测序验证和在BHK-21细胞上复制水平等方面,对成功拯救的病毒的毒力、遗传稳定性和生长特性等生物学活性进行探讨。同时利用原核表达的Fiber2蛋白作为包被抗原,建立检测FAdV抗体的间接ELISA方法。最后以成功拯救的病毒株、商品化弱毒LaSota疫苗株和亚单位Fiber2蛋白作为疫苗,免疫SPF鸡群并评价其免疫效果。结果显示,成功拯救出以NDV为载体表达FAdV-4 Fiber2抗原基因的重组毒株,命名为 rNDV-Fiber2。rNDV-Fiber2 的 MDT 大于 120 h,ICPI 和 IVPI 均为 0,为弱毒株,在鸡胚中传代无突变发生,且病毒在细胞上的复制水平和亲本毒一致。以Fiber2蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法具备良好的敏感性、特异性和重复性;当血清样品S/P值≥0.20时,判为FAdV抗体阳性,S/P值<0.20时则判为FAdV抗体阴性。免疫SPF鸡群后,rNDV-Fiber2组能诱导机体产生NDV特异性HI抗体、中和抗体及IgA黏膜免疫应答,但未能产生FAdV抗体,且免疫后3 d和5 d的外周血淋巴细胞（PBMCs）中CD8+与CD4+T淋巴细胞亚群比例呈显著上升趋势。免疫3周后以强毒株NDV97进行攻毒,rNDV-Fiber2组和LaSota组保护率均为100%,rNDV-Fiber2组未出现排毒且各脏器均无带毒,LaSota组部分鸡只出现排毒和脏器带毒的情况;以高致病性FAdV-4株进行攻毒,rNDV-Fiber2组保护率为0,出现排毒并呈现心包积液、肝肾肿大等现象,50 μg Fiber2和100 μg Fiber2疫苗组的保护率均为100%,且检测不到FAdV排毒和带毒情况,剖检脏器也无明显病变出现。结果表明,成功拯救出的rNDV-Fiber2与MG7株具有相似的生物学特性,都具备弱毒力特性,且能在后续的传代过程中稳定表达。以Fiber2蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法,检测灵敏性为96%、特异性为100%,且重复性良好,能为后续免疫鸡群FAdV抗体水平的检测提供一种可靠的方法。rNDV-Fiber2能有效诱导机体产生体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫应答,为NDV97的攻毒提供100%保护,且抑制NDV在体内的复制,虽未能诱导产生Fiber2抗体,对FAdV-4的攻毒保护率为0,但100μg和50 μg Fiber2蛋白均能获得100%保护。因此rNDV-Fiber2可否作为防控ND和HHS的基因工程二联苗亟待后期进一步试验研究。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 主要缩略语列表
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 质粒、细胞、毒株与血清
•     1.1.2 实验动物
•     1.1.3 主要试剂
•   1.2 方法
•     1.2.1 重组病毒rNDV-Fiber2的构建及拯救
•     1.2.2 rNDV-Fiber2的生物学特性研究
•     1.2.3 检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立
•     1.2.4 rNDV-Fiber2对SPF鸡免疫效果的评价
•   1.3 数据分析
• 2 结果与分析
•   2.1 重组病毒rNDV-Fiber2的构建及拯救
•     2.1.1 Fiber2目的基因的扩增
•     2.1.2 重组NDV基因组全长cDNA的构建
•     2.1.3 获救病毒的鉴定
•   2.2 rNDV-Fiber2的生物学特性研究
•     2.2.1 Western blotting检测Fiber2蛋白的表达
•     2.2.2 IFA试验
•     2.2.3 Fiber2基因的遗传稳定性
•     2.2.4 rNDV-Fiber2在BHK-21细胞上的生长特性
•     2.2.5 rNDV-Fiber2的毒力分析
•   2.3 检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立
•     2.3.1 Fiber2基因的扩增与重组质粒的构建
•     2.3.2 重组质粒pCold-Fiber2表达产物的鉴定
•     2.3.3 重组Fiber2蛋白的纯化与检测
•     2.3.4 检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法的建立
•     2.3.5 阈值的确定
•     2.3.6 交叉反应性试验
•     2.3.7 敏感性和特异性检验
•     2.3.8 重复性试验
•     2.3.9 田间样品检测
•   2.4 rNDV-Fiber2对SPF鸡免疫效果的评价
• 50测定'>    2.4.1 FAdV-4对SPF鸡的LD₅₀测定
•     2.4.2 免疫后鸡外周血T淋巴细胞亚群比例检测
•     2.4.3 间接ELISA方法检测SPF鸡血清中Fiber2特异性的抗体
•     2.4.4 检测SPF鸡血清中NDV HI抗体水平
•     2.4.5 间接ELISA方法检测SPF鸡眼泪中IgA特异性的抗体
•     2.4.6 中和试验检测SPF鸡血清中NDV中和抗体
•     2.4.7 攻毒后保护率情况
•     2.4.8 攻毒后病理解剖图
•     2.4.9 攻毒后的鸡体外排毒测定
•     2.4.10 攻毒后各脏器带毒情况
• 3 讨论
•   3.1 重组病毒rNDV-Fiber2的构建及拯救
•   3.2 rNDV-Fiber2的生物学特性研究
•   3.3 检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立
•   3.4 rNDV-Fiber2对SPF鸡免疫效果的评价
• 4 结论
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭浩然

导师: 李郁,朱启运

关键词: 新城疫病毒,血清型禽腺病毒,基因,细胞免疫,免疫保护效率

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000117

总页数: 67

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