穿透支原体Ferritin的表达、纯化及其抗氧化活性研究

论文摘要

背景:穿透支原体（M.penetrans,Mpe）是一种与艾滋病相关的支原体,因其能黏附并穿透真核细胞膜而得名。现在发现Mpe除了与艾滋病相关外,还与肿瘤的发生和发展也具有密切关系。人的免疫系统会产生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）来抵御病原菌的入侵。故Mpe在黏附感染并进入到宿主的过程中不可避免会遇到大量的ROS,抗氧化能力的强弱对于Mpe在宿主体内的存活及致病都极为重要。但迄今为止,Mpe的抗氧化机制仍不清楚。目的:本文构建能够表达穿透支原体Ferritin蛋白的原核表达质粒p ET15b-Ferritin,诱导表达Ferritin蛋白并利用亲和层析纯化,检测Ferritin蛋白的抗氧化活性,并测定它的免疫原性,为研究Ferritin蛋白在Mpe致病过程中的功能提供实验基础。方法:1.利用生物信息学方法分析Mpe的Ferritin蛋白的二级结构和三级结构等生物学特性。2.合成能够在大肠杆菌中表达全长Ferritin蛋白的编码基因,根据Ferritin基因序列设计特异性PCR引物,PCR扩增Ferritin基因。使用Nde I和Bam H I将Ferritin基因和表达质粒p ET15b进行双酶切,回收酶切产物,并用T4 DNA连接酶进行连接,获得重组质粒p ET15b-Ferritin,然后把重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21,得到重组菌BL21/p ET15b-Ferritin。3.使用IPTG诱导重组菌BL21/p ET15b-Ferritin以表达重组蛋白Ferritin,并利用Ni2+亲和层析法进行纯化,然后去内毒素并使用BCA法进行蛋白定量。4.利用分光光度法测定Ferritin蛋白的亚铁氧化酶活性,并测定Ferritin蛋白的抗氧化活性。5.测定能表达Ferritin蛋白的大肠杆菌和对照菌大肠杆菌在H2O2处理后的生长情况。6.将Ferritin蛋白免疫小鼠,获得抗血清,并测定其抗体滴度。结果:1.Mpe Ferritin基因全长为540 bp,编码180个氨基酸。Ferritin蛋白定位于细胞质,无信号肽。它的α-螺旋占71.5%,β-转角为6.7%,延伸链占5.0%,无规卷曲占16.8%。三级结构是由24个同源Ferritin蛋白分子组成的24聚体。Ferritin蛋白具有多个B细胞表位。2.成功构建了能编码含His标签的重组Ferritin蛋白的重组表达质粒p ET15b-Ferritin。将其转化到BL21得到重组菌BL21/p ET15b-Ferritin,IPTG能诱导重组菌表达22.9 k Da的重组Ferritin蛋白,亲和层析法获得了较高纯度的重组Ferritin蛋白。3.Ferritin蛋白能够快速催化Fe2+为Fe3+,具有亚铁氧化酶功能;Ferritin蛋白羟基自由基清除的半抑制浓度（IC50）为0.51 mg/m L,明显要低于BSA蛋白的IC50值（0.80 mg/m L）（p<0.05）。4.在H2O2处理后,转化p ET15b-Ferritin的大肠杆菌比转化p ET15b空载体的对照菌的存活率要高。5.将Ferritin蛋白免疫小鼠后,能够刺激小鼠分泌高滴度的抗体。结论:1.Mpe Ferritin具有亚铁氧化酶活性和抗氧化功能,能够提高大肠杆菌抵抗H2O2胁迫的能力,表明Mpe Ferritin蛋白具有抗氧化功能。2.Ferritin蛋白能够诱导小鼠分泌高滴度的抗体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要英文缩略语索引
• 第1章 绪论
• 第2章 材料和方法
• 第3章 实验结果
• 第4章 讨论
• 参考文献
• 第5章 结论
• 文献综述
•   参考文献
• 科研成果
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 何玲

导师: 曾焱华

关键词: 穿透支原体,铁蛋白,活性氧,免疫原性

来源: 南华大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物学,基础医学

单位: 南华大学

基金: 国家自然科学基金(31500156),“特殊病原体防控”湖南省重点实验室,湖南省分子靶标新药研究协同创新中心

分类号: R375;Q78

DOI: 10.27234/d.cnki.gnhuu.2019.000883

总页数: 64

文件大小: 3477K

下载量: 33