PGC7对其互作蛋白STAT1的磷酸化调控及在F9细胞多能性中的作用

论文摘要

PGC7是一个在哺乳动物生殖细胞、卵母细胞、植入前胚胎和多能性细胞中特异表达的母源效应因子。PGC7的表达状态与小鼠ES细胞的多能性水平有关,PGC7的高表达水平也有助于维持胚胎干细胞和内细胞团的低甲基化水平,这些结果表明PGC7在维持细胞多能性方面发挥重要作用。Nanog由305个氨基酸组成,具有保守的同源异型结构域,在小鼠植入前胚胎和ES细胞等多能性细胞中特异性表达,随着细胞多能性下降而表达量降低,表明Nanog对于多能性的维持存在剂量效应,并且表达水平与细胞分化程度和多能性层次密切相关。STAT家族蛋白包括STAT1-4、STAT5a、STAT5b和STAT6,已经有研究表明STAT家族蛋白对胚胎干细胞多能性的调控存在贡献。LIF/gp130/STAT3信号通路是发现最早的小鼠ES细胞多潜能性维持通路,LIF通过激活STAT3来调控靶基因表达,抑制ES细胞的分化,从而维持小鼠ES细胞的多能性状态。我们的前期研究发现一种独立于LIF-JAK-STAT3的新的途径,即Vc可以激活JAK2/STAT2信号传导途径,而活化的STAT2结合到Nanog启动子的近端区域并在ESC中促进Nanog的表达,从而发挥其调控胚胎细胞多能性的功能。STAT1参与多种生物学过程中的基因表达调控,如胚胎发育,细胞程序性死亡,先天免疫,适应性免疫和生物体中的细胞增殖调节,目前还未见STAT1参与调控胚胎干细胞多能性的报道。本课题组前期利用质谱鉴定出了PGC7互作蛋白网络,发现STAT1是PGC7的互作候选蛋白。本实验围绕STAT1与PGC7之间的相互作用,研究其在干细胞多能性维持方面的作用机制。主要研究内容和结果如下:（1）PGC7-STAT1互作结合情况分析及PGC7对于STAT1亚细胞定位的影响。首先,本研究通过对STAT1的结构域组成进行分析,针对其五个结构域分别构建截短重组真核表达载体,利用蛋白质免疫共沉淀技术检测PGC7与STAT1的结合情况。结果表明,缺失STAT1的任一结构域均不影响STAT1与PGC7的互作,即PGC7与STAT1存在广泛的互作关系。随后通过免疫荧光染色观测PGC7与STAT1的亚细胞定位,发现PGC7与STAT1核质均有分布,但当PGC7与STAT1共表达时STAT1进核情况明显,即PGC7可以促进STAT1的核定位。（2）PGC7对于STAT1的活性调控。首先,通过Co-iP检测PGC7对于STAT1与其磷酸酯酶PTPN6a的互作结合情况影响,结果表明PGC7可以抑制STAT1与其磷酸酯酶的互作结合。随后,通过WB检测PGC7对于STAT1的磷酸化水平的影响,结果显示PGC7可以提高STAT1的磷酸化水平,结合上述结果说明PGC7通过抑制STAT1的磷酸酯酶对其磷酸基团的水解过程,进而提高了STAT1的磷酸化水平。最后,通过双荧光素酶报告实验检测PGC7对于STAT1转录活性的影响,结果表明PGC7可以激活STAT1的转录活性。综上所述,PGC7通过拮抗STAT1的特异性磷酸酯酶对其磷酸基团的水解过程,提高了STAT1的磷酸化水平,最终,激活了STAT1的转录活性并促使其转运入核。（3）PGC7与STAT1的互作对于多能性的作用。首先,通过双荧光素酶报告实验检测Nanog的启动子活性,结果表明PGC7和STAT1均可以增强Nanog的启动子活性,且两者的互作会使Nanog启动子活性进一步提升。随后,利用实时荧光定量检测Nanog和OCT4的转录水平,结果表明,PGC7与STAT1的相互作用可以显著提升Nanog和OCT4基因的表达水平。最后,通过AP染色检测F9细胞整体多能性状态,结果表明PGC7和STAT1的互作可以拮抗RA诱导细胞多能性的下降,显著提升F9细胞的多能性水平,参与胚胎干细胞的多能性维持。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 PGC7 的生物学功能及研究进展
•     1.1.1 PGC7 的生物学特征
•     1.1.2 PGC7 在早期胚胎发育中的作用
•     1.1.3 PGC7在DNA甲基化调控中的作用
•     1.1.4 PGC7 在染色质调控中的作用
•     1.1.5 PGC7 在多能性中的作用
•   1.2 STAT家族蛋白研究进展
•     1.2.1 STAT家族蛋白概述
•     1.2.2 STAT家族蛋白在调控细胞多能性中的作用
• 第二章 PGC7与STAT1 互作验证及对STAT1 细胞定位的影响
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 仪器与耗材
•     2.1.4 主要溶液配制
•     2.1.5 细胞培养与传代
•     2.1.6 总RNA提取与反转录
•     2.1.7 STAT1 标签表达载体构建载体构建
•     2.1.8 细胞转染
•     2.1.9 免疫印迹（Western Blot,WB）
•     2.1.10 蛋白质免疫共沉淀（Co-iP）
•     2.1.11 免疫荧光染色
•   2.2 结果
•     2.2.1 STAT1 真核表达载体构建
•     2.2.2 PGC7与STAT1 的互作验证
•     2.2.3 STAT1 结构域分析
•     2.2.4 STAT1 及其截短体真核表达载体构建
•     2.2.5 PGC7与STAT1 互作结构域分析
•     2.2.6 PGC7与STAT1 的细胞内共定位
•     2.2.7 PGC7与STAT1 截短体的细胞内共定位
•     2.2.8 PGC7对STAT1 的磷酸化水平的影响
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第三章 PGC7 激活STAT1 的活性
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 材料
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 仪器与耗材
•     3.1.4 主要溶液配制
•     3.1.5 细胞培养与传代
•     3.1.6 总RNA提取与反转录
•     3.1.7 PTPN6a表达载体构建
•     3.1.8 细胞转染
•     3.1.9 蛋白质免疫共沉淀（Co-Ip）
•     3.1.10 双荧光素酶报告实验
•   3.2 结果
•     3.2.1 PTPN6a真核表达载体构建
•     3.2.2 磷酸化修饰蛋白的免疫印迹法（Phosphorylated Western Blot）
•     3.2.3 蛋白质免疫共沉淀检测PGC7 对于PTPN6a与 STAT1 的互作影响
•     3.2.4 双荧光素酶报告实验检测ISRE报告载体活性
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第四章 PGC7与STAT1 的互作参与胚胎干细胞多能性维持
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 仪器与耗材
•     4.1.4 主要溶液配制
•     4.1.5 细胞培养与传代
•     4.1.6 双荧光素酶报告实验
•     4.1.8 SYBR实时荧光定量
•     4.1.9 AP染色（Alkaline phosphatase staining）
•   4.2 结果
•     4.2.1 PGC7与STAT1 对于Nanog启动子活性的影响
•     4.2.2 PGC7与STAT1 对于Nanog和 OCT4 基因表达水平的影响
•     4.2.3 PGC7与STAT1 对于F9 细胞整体多能性水平的影响
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 方景帅

导师: 郭泽坤

关键词: 蛋白质相互作用,基因表达调控

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然基金(编号:31872355)

分类号: Q344

总页数: 67

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