全文摘要
本发明提供了一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及其应用，属于蛋白质多肽技术领域，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQIDNo：1所示的氨基酸序列。所述皮层肌动蛋白突变体8KQ为将皮层肌动蛋白(NP_031829.2)的8个赖氨酸位点K107、K152、K171、K181、K193、K235、K309和K314突变为谷氨酰胺，模拟蛋白质乙酰化状态下的电荷特征。本发明所述皮层肌动蛋白突变体8KQ能够在培养细胞中成功表达，能够降低与纤维状肌动蛋白结合能力；可用于改善神经突触形态；可改善自闭症疾病模型小鼠的重复刻板行为，起效快，作用明显。
主设计要求
1.一种皮层肌动蛋白突变体8KQ，其特征在于，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQIDNo：1所示的氨基酸序列。
设计方案
1.一种皮层肌动蛋白突变体8KQ，其特征在于，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQID No：1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因，其特征在于，具有如SEQ IDNo：2所示的核苷酸序列。
3.一种重组病毒，其特征在于，包括权利要求2中编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因和病毒载体。
4.根据权利要求3所述的重组病毒，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒或慢病毒。
5.根据权利要求4所述的重组病毒，其特征在于，所述腺相关病毒为腺病毒9型。
6.权利要求1所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备神经保护药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经保护表现为补充皮层肌动蛋白乙酰化，维持兴奋性突触形态结构与功能稳定。
8.权利要求1所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备治疗自闭症药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述自闭症药物的适用对象为自闭症疾病模型小鼠。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述自闭症药物为注射制剂。
设计说明书
技术领域
本发明属于蛋白质多肽技术领域，尤其涉及一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及其应用。
背景技术
自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一类神经发育性疾病，可通过临床表现诊断。最新的《精神疾病诊断与统计手册》第五版、对ASD的诊断标准归纳为：社会交流障碍、重复刻板的动作或兴趣，如：很少与人交流、躲避对话者目光、喜欢重复旋转的玩具等。除了上述的核心症状外，ASD患者还可能表现出其他非典型的附加症状，如不同程度的智力障碍、失眠、焦虑、多动、癫痫等。在2000年ASD的发病率约为1～2‰。但随着诊断标准和诊断方式的改进，2017年发展中国家儿童ASD发病率已经达到1.5％，目前临床多以行为干预为主，研制ASD治疗潜能的药物极为重要。
ASD的发病原因不明确，目前研究认为与基因遗传和环境因素有关。遗传变异呈现高度异质性，限制了ASD发病机制研究和临床药物研发。临床病例观察和疾病动物模型研究表明，ASD存在严重的神经突触功能紊乱。许多ASD候选易感基因集中于兴奋性突触位点，包括突触支架蛋白、受体、细胞粘附分子和细胞骨架调节蛋白等编码基因以及它们的上游调节基因，这些遗传学变异直接影响树突棘形态和结构，从而改变兴奋性突触数目和强度，最终导致突触功能紊乱。SHANK3(SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3)基因突变是第一个被报道、且被报道最多的与先天性ASD相关联的基因，它编码突触后支架蛋白，通过与突触后致密蛋白95(PSD95)、Homer形成蛋白复合物，锚定谷氨酸受体于突触后膜，维持突触功能的稳定。生理条件下SHANK3与皮层肌动蛋白相互作用，维持兴奋性突触形态和结构的稳定。在突触分布的皮层肌动蛋白是乙酰化形式，当它乙酰化水平降低时，削减突触传递的幅值，阻碍神经元之间信息传递。现有技术对ASD候选易感基因的研究多集中在基因水平。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种皮层肌动蛋白突变体8KQ及其应用；所述皮层肌动蛋白突变体8KQ通过模拟乙酰化的皮层肌动蛋白，有效改善兴奋性突触形态结构与功能，起到神经保护的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种皮层肌动蛋白突变体8KQ，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。
本发明提供了编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种重组病毒，包括编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因和病毒载体。
优选的，所述病毒载体为腺相关病毒或慢病毒。
优选的，所述腺相关病毒为腺病毒9型。
本发明提供了所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备神经保护药物中的应用。
优选的，所述神经保护表现为补充皮层肌动蛋白乙酰化，维持兴奋性突触形态结构与功能稳定。
本发明提供了所述的皮层肌动蛋白突变体8KQ在制备治疗自闭症药物中的应用。
优选的，所述自闭症药物的适用对象为自闭症疾病模型小鼠。
优选的，所述自闭症药物为注射制剂。
本发明的有益效果：本发明提供的皮层肌动蛋白突变体8KQ，具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列；所述皮层肌动蛋白突变体8KQ为将皮层肌动蛋白(NP_031829.2)的8个赖氨酸位点K107、K152、K171、K181、K193、K235、K309和K314突变为谷氨酰胺，模拟蛋白质乙酰化状态下的电荷特征。本发明所述皮层肌动蛋白突变体8KQ能够在培养细胞中成功表达，能够降低与纤维状肌动蛋白结合能力；将所述皮层肌动蛋白突变体8KQ构建在慢病毒载体上可收获病毒颗粒，获得大量持续乙酰化皮层肌动蛋白突变体，用于改善神经突触形态；将所述皮层肌动蛋白突变体8KQ构建在腺相关病毒载体，脑内注射有效改善自闭症疾病模型小鼠的重复刻板行为，起效快，作用明显。
本发明将编码所述皮层肌动蛋白突变体8KQ的基因重组至腺相关病毒或慢病毒中，能够实现皮层肌动蛋白突变体8KQ的大量表达，规模化工业生产，应用于改善突触形态和功能紊乱药物组合，用于制备神经保护类药物。
附图说明
图1为兴奋性突触表达乙酰化皮层肌动蛋白，其中(A)为体外培养的神经元(DIV21)免疫荧光染色图片；(B)为PSD95与cortactin、ac-cortactin的共定位分析；
图2为皮层肌动蛋白与不同浓度的Ac-CoA共同孵育后乙酰化水平；左图为westernblot检测的乙酰化皮层肌动蛋白的表达水平，考马斯亮蓝染色显示了底物皮层激动蛋白的量；右图为western blot结果中乙酰化皮层肌动蛋白相对水平的统计图，定义对照组乙酰化皮层肌动蛋白水平为100％，数据来源于三次独立实验；
图3为皮层激动蛋白乙酰化位点的鉴定，其中(A)为LC-MS\/MS鉴定得到皮层肌动蛋白重复区域中8个赖氨酸被乙酰化；(B)为HEK293细胞过表达HA标签的皮层肌动蛋白突变体8KQ和western blot检测质粒表达；
图4为F-actin结合半定量实验结果图；
图5为过表达8KQ对神经元兴奋性突触后电流的影响，其中(A)为过表达8KQ的神经元与对照的神经元兴奋性突触后电流整体的比较，(B)为电流的振幅比较，(C)为电流的频率比较；
图6为乙酰化皮层肌动蛋白的模拟形式对改善小鼠ASD样行为学影响；其中(A)为腺相关病毒脑立体定位注射示意图；(B)为腺相关病毒注射和行为学测试时间安排示意图；(C)为每组小鼠重复刻板实验中自主理毛时间比较。
具体实施方式
本发明提供了一种皮层肌动蛋白突变体8KQ，所述皮层肌动蛋白突变体8KQ具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，具体如下：
设计图
相关信息详情
申请码:申请号:CN201910062073.6
申请日:2019-01-23
公开号:CN109608534A
公开日:2019-04-12
国家:CN
国家/省市:82(吉林)
授权编号:CN109608534B
授权时间:20190809
主分类号:C07K 14/47
专利分类号:C07K14/47;C12N15/12;C12N7/01;A61K38/17;A61P25/00
范畴分类:18G;
申请人:东北师范大学
第一申请人:东北师范大学
申请人地址:130000 吉林省长春市人民大街5268号
发明人:朱筱娟;马俊;王雅君;贺子轩;何潇潇;张禄卿;郑耀武;俞华莉;申瑞雪
第一发明人:朱筱娟
当前权利人:东北师范大学
代理人:刘奇
代理机构:11569
代理机构编号:北京高沃律师事务所
优先权:关键词:当前状态:审核中
类型名称:外观设计