牛分枝杆菌MarP蛋白的表达纯化及其单克隆抗体制备

论文摘要

为制备能够特异性识别牛分枝杆菌（M.bovis）抗酸蛋白酶（MarP）的特异性单克隆抗体（MAb）,本研究利用大肠杆菌表达系统表达了MarP蛋白的胞浆区,并以β-casein为底物、DTT为抑制剂检测MarP的丝氨酸蛋白酶活性。以具有活性的MarP蛋白免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,并加入饲养层细胞轻轻摇匀分装于96孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱内培养10 d,通过IFA和间接ELISA筛选阳性细胞株进行亚克隆,制备能分泌针对MarP MAb的杂交瘤细胞株,并通过Western blotting和ELISA检测MAb与重组表达和天然的MarP蛋白的反应性。结果显示,重组表达的MarP具有良好的丝氨酸蛋白酶活性,能够在12 h内将30μg的β-casein酶解完全,DTT能够抑制MarP的酶活性。具有活性的MarP蛋白免疫小鼠后,获得5株针对MarP的MAb,均能够特异性识别重组和牛分枝杆菌天然表达的MarP蛋白的线性表位,而不与大肠杆菌（E.coli）和耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）的蛋白反应。本研究成功制备了MarP蛋白及MAb,为进一步研究MarP的作用底物及其在牛分枝杆菌抗酸胁迫中作用机制提供了必备材料。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 质粒、菌株和试验动物
•   1.2 主要试剂
•   1.3 MarP的序列分析及基因扩增
•   1.4 重组蛋白的表达及纯化
•   1.5 重组蛋白的鉴定
•     1.5.1 重组蛋白的MS鉴定
•     1.5.2 重组蛋白的活性检测
•   1.6 MarP MAb的制备
•   1.7 MAb的鉴定
•     1.7.1 MAb的亚类鉴定
•     1.7.2 检测MAb与MarP间的反应
•       1.7.2.1 Western blotting检测MAb与纯化的MarP反应性
•       1.7.2.2 Western blotting检测MAb与天然MarP的反应性
• 2 结 果
•   2.1 MarP基因扩增及序列分析
•   2.2 重组蛋白表达及纯化结果
•   2.3 重组蛋白的质谱鉴定
•   2.4 重组蛋白的活性鉴定
•   2.5 MarP MAb的鉴定
• 3 讨 论
• 4 结 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 林伟东,隋修锟,王召阳,贾红,房立春,王海春,朱良全,鑫婷

关键词: 牛分枝杆菌,抗酸,抗酸蛋白酶,单克隆抗体,丝氨酸蛋白酶

来源: 中国畜牧兽医 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,比利时列日大学让布鲁农学院分子生物学实验室,中牧实业股份有限公司,中国兽医药品监察所

基金: 国家自然科学基金项目(31602086),“十三五”国家重点研发计划(2016YFD0500902,2017YFD0500906),北京市自然科学基金(6164039)

分类号: S852.618

DOI: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2019.06.025

页码: 1774-1782

总页数: 9

文件大小: 2441K

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