猪流行性腹泻病毒遗传变异与进化分析

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）感染猪只所引起的以呕吐、急性水样腹泻、脱水和体重减轻为临床特征的高度接触性肠道传染病。自2010年底我国南方首先暴发新的PED疫情以来,PEDV迅速席卷了我国各省市地区,给我国养猪行业造成了巨大的经济损失。为了能够更加深入地了解我国现阶段PEDV的流行趋势、遗传变异及其分子演化历程,本研究对2016年底至2018年底所采集的疑似腹泻病料进行了检测和分析,并对部分毒株S基因和全基因组进行测序用以后续的遗传变异分析与分子演化研究。具体结果如下:1.现阶段我国PEDV流行情况本研究中,我们自2016年底至2018年底从湖北、山东、河南、湖南、浙江、广东等18省不同地区不同猪场采集肠组织、粪便病料共计898份,其中肠组织病料636份、粪便病料262份。经检测,PEDV肠组织病料阳性232份,阳性检测率为36.48%;粪便病料阳性81份,阳性检测率为30.92%;检测PEDV总阳性率为34.86%。选择不同发病猪场的部分强阳性样品进行S基因序列测定,共测序76株毒株的S全长基因序列。依据不同省份内S基因的序列一致性差异,仅保留一条序列并去除其余序列一致性达99%以上的S基因序列,最终筛选得到45条S基因序列用于系统发育分析。根据S基因构建的NJ系统发育进化树分析,可将PEDV分为G1型和G2型,又可细分为G1-a亚型（经典毒株及其来源的疫苗毒株）、G1-b亚型（S-INDEL毒株）、G2-a亚型（变异毒株）、G2-b亚型（重组毒株）。结果显示,本研究所检测测序的45株毒株中,44株毒株为G2-a亚型（变异毒株）,1株毒株为G1型,揭示我国现阶段PEDV流行毒株主要仍是以G2-a亚型变异毒株为主。44株G2-a亚型PEDV毒株依据S基因NJ系统发育树可进一步细分为3个簇,主要以G2-a1簇和G2-a3簇为主。E3-SX2017、V1-HB2018、E6-SN2017等17株所测序的毒株为G2-a1簇,亲缘关系上与XM2-4、HBXY1更为接近,序列一致性在95.7%-99.5%之间。M3-SX2017、G2-HE2017、Z7-HA2018等23株所测序的毒株均为G2-a3簇,亲缘关系上与AJ1102、YN1更为接近,序列一致性在95.8%-99.6%之间。2.PEDV S基因遗传变异具有多样性本研究中将45株PEDV S基因序列与变异毒株AJ1102,经典毒株CV777、LZC,减毒疫苗毒株attenuated CV777,S-INDEL毒株ZL29,细胞传代适应毒株YN144,自然弱毒毒株FL2013以及重组毒株CH/HNQX-3/14 S基因进行比对分析。在氨基酸插入与缺失方面,G7-SC2017、W3-AH2018、Y9-SX2018三株G2-a亚型毒株在第59-62位氨基酸位点仅有两个氨基酸插入,与绝大多数G2-a亚型毒株不同。同时也发现,21株G2-a亚型毒株其S蛋白C端第1199位氨基酸发生突变,而有23株G2-a亚型毒株发生缺失。S蛋白抗原表位方面,SS6与COE抗原表位易发生突变,其中,COE抗原表位第526位氨基酸最为复杂,由L可突变为H/Y/R/N;而保守抗原表位SS2、2C10也有氨基酸发生突变。V7-HB2018为本研究中唯一测得的G1型毒株,其虽与已知的S-INDEL毒株S蛋白在氨基酸插入和缺失上极为相似,但在S基因水平上存在一定的差异,序列一致性仅为97.0%-97.5%。测得其全基因组序列,进一步生物信息学重组分析发现其为一株新重组的S-INDEL毒株,亲本毒株为CH/ZMDZY/11和CV777,Simplot分析其断点为20721nt-21341nt。3.基于PEDV全基因组分析其演化历程参考PEDV CV777与AJ1102全基因组序列,设计17对引物用以扩增PEDV全基因组序列,共扩增得到8株G2型PEDV全基因组,1株G1型PEDV全基因组（V7-HB2018）。从GenBank数据库中再获取我国G2型PEDV全基因组序列58条,早期韩国G2型PEDV全基因组序列1条,利用BEAST对其进行分析并构建MCC系统发育树,可知我国G2型PEDV的碱基替换速率为1.0487×10-3次/位点/年,其最近共同祖先株起源时间（tMRCA）为26.4059年以前（即1991年）。基于Bayesian Skyline Plot分析,我国G2型PEDV有效种群规模经历过两次扩张,其中最近一次为2010至2012年,与2010年底我国暴发PED疫情事实符合。利用DataMonkey对我国G2型PEDV毒株结构基因进行正选择位点分析,发现S蛋白上存在三个正选择位点,N蛋白上存在一个正选择位点,而在M蛋白与E蛋白中未发现相关正选择位点。其中,位于S蛋白上的三个正选择位点分别位于S1-NTD与S1-CTD重叠区域、S1-CTD以及COE中和抗原表位,此三处正选择位点发生适应性突变可能会增加病毒的感染力、逃避宿主免疫,促使其能不断适应新的环境。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表语（Abbreviation）
• 1 文献综述
•   1.1 猪流行性腹泻病毒
•   1.2 PEDV临床症状及发病机制
•   1.3 PEDV流行情况
•     1.3.1 PEDV在欧洲流行
•     1.3.2 PEDV在亚洲流行
•     1.3.3 PEDV在美洲流行
•   1.4 PEDV起源时间
•   1.5 PEDV S基因
•     1.5.1 S基因结构与功能
•     1.5.2 S基因多样性
• 2 研究目的及意义
• 3 材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 病料
•     3.1.2 工具酶和主要试剂
•     3.1.3 主要实验仪器及设备
•     3.1.4 主要缓冲液与相关试剂的配制
•     3.1.5 分子生物学分析软件
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 病料处理与组织破碎
•     3.2.2 病毒RNA提取
•     3.2.3 病毒基因组反转录
•     3.2.4 病毒检测
•     3.2.5 电泳检测PCR产物
•     3.2.6 PEDV S基因扩增
•     3.2.7 PCR产物回收与纯化
•     3.2.8 DNA片段与载体的连接
•     3.2.9 重组产物转化
•     3.2.10 重组质粒的菌落PCR鉴定
•     3.2.11 挑菌
•     3.2.12 小提质粒
•     3.2.13 测序
•     3.2.14 PEDV全基因组分段克隆
•     3.2.15 基于S基因构建NJ系统发育树
•     3.2.16 基于PEDV全基因组分子演化
• 4 结果
•   4.1 我国现阶段PEDV流行情况
•     4.1.1 PEDV流行毒株检测
•     4.1.2 基于PEDV S基因的系统发育分析
•   4.2 PEDV S蛋白多样性
•     4.2.1 S蛋白遗传变异分析
•     4.2.2 S蛋白表面抗原突变分析
•     4.2.3 PEDV V7-HB2018 全基因组测序及分析
•   4.3 基于PEDV全基因组分析其演化历程
•     4.3.1 时间信号检测
•     4.3.2 G2型PEDV毒株全基因组MCC系统发育树构建
•     4.3.3 我国G2型PEDV碱基替换速率
•     4.3.4 我国G2型PEDV起源时间
•     4.3.5 通过Bayesian skyline plot动态分析PEDV的进化特征
•     4.3.6 PEDV各结构基因正选择位点分析
• 5 讨论与结论
•   5.1 讨论
•     5.1.1 现阶段我国PEDV流行情况
•     5.1.2 PEDV S蛋白遗传变异的多样性
•     5.1.3 基于PEDV全基因组分析其演化历程
•   5.2 结论
• 参考文献
• 附录
•   附表一 基于PEDV S基因构建系统发育树所用参考序列信息
•   附表二 G2型PEDV毒株全基因组序列信息
•   附表三 本研究中所测定的PEDV毒株信息
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 敖超杰

导师: 江云波

关键词: 猪流行性腹泻病毒,基因,遗传变异,分子演化

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000313

总页数: 84

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