表层蛋白对乳杆菌益生性质的影响及其抑菌功能

论文摘要

乳杆菌表层蛋白作为乳杆菌细胞壁外的一层特殊结构,已被证明具有保护菌体完整性和益生性质的作用。近年来,越来越多的研究开始关注表层蛋白自身的生物学功能如抗氧化作用、免疫功能以及抑菌作用等,但其对表层蛋白生物学功能的作用机制以及研究范围仍旧比较有限。本论文从表层蛋白对乳杆菌益生性质的影响开始研究,进一步探究纯化后表层蛋白的黏附、抗炎以及抑菌功能,旨在发现乳杆菌表层蛋白更多的生物学功能,为其进一步的研究和应用提供理论依据。首先通过提取和电泳鉴定筛选出7株携带表层蛋白的乳杆菌,Lactobacillus.acidophilus NCFM、L.acidophilus ATCC 4356、L.acidophilus CGMCC 1.1878、L.fermentum CCFM 421、L.gohnsnil JCM 1101、L.crispatus JCM 2009、L.fermentum CCFM Y40。使用LiCl去除7株乳杆菌的表层蛋白后,菌株自聚率、表面电荷吸附率、与沙门氏菌共聚率相较完整菌株均显著下降（P<0.05）。菌株疏水性除L.acidophilus NCFM外均较完整菌株显著降低（P<0.05）,表明表层蛋白的存在对乳杆菌上述表面性质有积极作用。模拟胃肠道耐受实验发现,LiCl处理后的菌株在模拟胃肠环境中的存活率较完整菌株显著降低（P<0.05）,表明表层蛋白对胃肠道环境下的乳杆菌具有保护作用。乳杆菌黏附HT-29细胞实验结果显示,在去除表层蛋白之后,7种乳杆菌黏附率较之前均显著下降,其中L.acidophilus NCFM下降最大,达到73.6%（P<0.05）。纯化得到了4株乳杆菌的表层蛋白（L.acidophilus NCFM、L.acidophilus CGMCC1.1878、L.fermentum CCFM 421、L.crispatus 2009）,发现4种表层蛋白在排除、竞争、替换三种处理方式下均可以显著抑制大肠杆菌和沙门氏菌对HT-29细胞的黏附（P<0.05）,但不同方式的作用效果不同。表明表层蛋白可以通过与致病菌竞争黏附位点或掩盖干扰其识别黏附位点等方式拮抗致病菌对HT-29细胞的黏附。通过对大肠杆菌感染的HT-29细胞的细胞活力和IL-8分泌的测定,发现L.acidophilus NCFM表层蛋白能够抑制大肠杆菌诱导的HT-29细胞的IL-8的上调,表明表层蛋白具有调节炎症和免疫反应的作用,能够调节炎症反应相关的IL-8促炎症因子。进一步探究表层蛋白对致病菌的抗菌作用,通过生长曲线和活菌计数证实L.acidophilus NCFM和L.acidophilus CGMCC 1.1878的表层蛋白具有提高Nisin抑制金黄色葡萄球菌抑菌活性的作用。Nisin单独或与表层蛋白联合处理时,可以观察到显著的膜透性变大以及A260nm吸收物质的释放（P<0.05）。此外,流式细胞仪检测结果表明Nisin与表层蛋白的联合抑菌机理涉及细胞内酶活力的降低,细胞膜损伤以及细胞膜电位的降低。未来可能通过二者的联合使用,解决Nisin的抗药性问题。综上,本论文研究发现携带表层蛋白对菌体表面性质、胃肠道耐受性以及黏附功能具有积极作用。纯化的表层蛋白能够拮抗致病菌黏附及调节致病菌诱导的细胞炎症反应。此外可与Nisin联合使用抑制S.aureus。研究显示了乳杆菌表层蛋白对菌株益生功能的贡献及自身抑菌和免疫调节方面的潜能,为其进一步的开发利用提供了基础数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要缩略词表
• 1 绪论
•   1.1 乳杆菌及其表层蛋白
•   1.2 乳杆菌表层蛋白的结构及鉴定
•   1.3 乳杆菌表层蛋白功能的研究进展
•     1.3.1 乳杆菌表层蛋白对菌体的保护作用
•     1.3.2 乳杆菌表层蛋白对菌体黏附功能的影响
•     1.3.3 乳杆菌表层蛋白的抗炎免疫功能
•     1.3.4 乳杆菌表层蛋白的抑菌作用
•   1.4 存在问题
•   1.5 立题意义
•   1.6 主要研究内容
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验菌株
•     2.1.2 实验试剂
•   2.2 主要仪器与设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌株的活化和传代
•     2.3.2 细胞培养
•     2.3.3 乳杆菌表层蛋白的提取和鉴定
•     2.3.4 乳杆菌表层蛋白的分离纯化
•     2.3.5 乳杆菌表面性质的测定
•     2.3.6 乳杆菌耐受性的测定
•     2.3.7 乳杆菌黏附HT-29 细胞黏附率的测定
•     2.3.8 乳杆菌表层蛋白对致病菌黏附HT-29 细胞黏附抑制率的测定
•     2.3.9 细胞活性测定
•     2.3.10 HT-29 细胞上清中的IL-8 的测定
•     2.3.11 Nisin对致病菌MIC值的测定
•     2.3.12 致病菌生长抑制率和致死率的测定
•     2.3.13 胞内核酸泄露的测定
•     2.3.14 细胞膜通透性的测定
•     2.3.15 细菌损伤亚致死的测定
•     2.3.16 膜电位的测定
•     2.3.17 统计与分析
• 3 结果与讨论
•   3.1 乳杆菌表层蛋白的分离纯化
•     3.1.1 携带表层蛋白乳杆菌的筛选
•     3.1.2 乳杆菌表层蛋白的分离纯化
•   3.2 携带表层蛋白对乳杆菌表面性质的影响
•     3.2.1 携带表层蛋白对菌株自聚集的影响
•     3.2.2 携带表层蛋白对菌株疏水性的影响
•     3.2.3 携带表层蛋白对菌株表面电荷的影响
•     3.2.4 携带表层蛋白对乳杆菌共聚集率的影响
•   3.3 携带表层蛋白对乳杆菌耐受性的影响
•     3.3.1 LiCl对乳杆菌致死率的影响
•     3.3.2 携带表层蛋白对菌株在模拟胃肠液中耐受性的影响
•   3.4 乳杆菌表层蛋白对HT-29 黏附性质及炎症反应的影响
•     3.4.1 携带表层蛋白对菌体黏附HT-29 细胞能力的影响
•     3.4.2 乳杆菌表层蛋白对致病菌黏附HT-29 细胞的拮抗作用
•     3.4.3 乳杆菌表层蛋白对E.coli诱导的HT-29 细胞炎症反应的调控作用
•   3.5 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对致病菌的抑制
•     3.5.1 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对致病菌生长的影响
•     3.5.2 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对致病菌的致死作用
•     3.5.3 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对S.aureus细胞内核酸物质泄漏的影响
•     3.5.4 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对S.aureus细胞膜通透性的影响
•     3.5.5 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对S.aureus损伤亚致死的影响
•     3.5.6 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对S.aureus电位的影响
•     3.5.7 乳杆菌表层蛋白与Nisin组合对S.aureus形态的影响
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 牛钰涵

导师: 卢蓉蓉

关键词: 表层蛋白,乳杆菌,表面性质,黏附,联合抑菌

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS201.3

总页数: 59

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