导读:本文包含了抗重组单链抗体论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:抗体,抗原,核糖体,复性,胆酸,噬菌体,特异性。
抗重组单链抗体论文文献综述
崔锡平[1]（2018）在《抗甘胆酸的重组单链抗体制备与免疫分析方法研究》一文中研究指出甘胆酸(glycocholicacid,GCA),属于二级胆酸,是类固醇酸的衍生物,由胆酸和甘氨酸在肝脏中结合生成的结合型胆酸,是胆汁酸的主要成分之一。GCA具有促进脂类乳化,加速脂类物质的消化和吸收的作用。GCA在血液和尿液中的浓度高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。因此,建立GCA的检测方法对其进行有效监测可以为各类肝脏疾病的鉴别、诊断、治疗和预后分析提供重要的依据。目前,GCA的检测方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、免疫学分析法等等。免疫分析法基于抗体和抗原之间特异性结合,具有灵敏度高、特异性强、简单、快速和便宜等优点,特别适用于大批量样本的筛查。抗体是影响免疫分析方法特异性和灵敏性的重要因素之一。传统的抗体包括多克隆抗体(polyclonal antibodies,pAb)和单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAb);然而,这两种抗体存在着某些缺点,例如在多克隆抗体制备中批次与批次之间的差异;在单克隆抗体制备中耗时、生产成本高和步骤复杂等等。通过噬菌体展示技术,可以从抗体文库中淘选到具有高亲和力的重组抗体,并可通过测序获得抗体的编码序列。单链抗体(single-chian variable fragment,scFv)是最常见的重组抗体之一,是能够保持与抗原有效结合的最小单位,由轻链和重链可变区通过一段编码连接肽基因拼接后表达的重组蛋白。ScFv抗体具有易于原核表达和基因工程改造等优点,目前已广泛应用于医疗诊断、疾病治疗、环境监测和食品安全分析等领域。本研究以GCA为靶标,通过噬菌体展示技术筛选到了高亲和力的scFv抗体,主要研究结果如下:1.噬菌体展示单链抗体文库的构建和淘选1.1通过完全抗原GCA-BSA对母鸡进行免疫,构建了库容量为3.34 × l07cfu的噬菌体scFv抗体文库。利用GCA标准品竞争洗脱的方式,进行了四轮条件苛刻的淘选后,通过phage-ELISA的方法对淘选后的抗体文库进行鉴定,对筛选到的阳性克隆子进行DNA测序分析,共获得4种具有高亲和力scFv的序列。2.抗GCA特异性单链抗体的原核表达及应用2.1将灵敏度最高的噬菌粒scFv-G11进行原核表达和纯化,建立了基于scFv抗体检测尿液中GCA的间接竞争ELISA,灵敏度(IC50)为0.06 μg/mL,线性范围(IC20～IC80)为 0.02～0.18 μg/mL,最低检测限(limit of detection,LOD)为 0.01 μg/mL,与 TCA 的交叉反应率为40%,与其它结构类似的胆酸的交叉反应率均低于0.58%。在尿液中的添加回收率为86～123%,并将检测结果与LC-MS/MS进行比对,结果显示两者具有良好的相关性(R2=0.99)。3.生物素化单链抗体的制备及应用3.1分别通过化学法和酶催化法,将生物素标记scFv抗体。结果显示,酶催化生物素法标记scFv抗体所建立的ELISA具有更高的灵敏性。利用酶催化法标记的scFv抗体建立了间接竞争BA-ELISA,IC50值为0.42μg/mL,线性范围(IC20～IC80)为0.14～1.24μg/mL,检测限LOD为0.07μg/mL,与TCA的交叉反应率为43.75%,与其它结构类似的胆酸的交叉反应率均低于1.88%。在尿液中的添加回收率为110.8～125.6%,检测结果与LC-MS/MS进行比对,结果显示两者相关性良好(R2= 0.99)。综上所述,本研究利用噬菌体展示技术筛选到了 4个高灵敏度的scFv抗体。此外,将具有较高灵敏度的scFv抗体,通过酶催化法,将生物素标记到scFv抗体。通过scFv抗体和生物素化的scFv抗体,分别建立了 ELISA和BA-ELISA检测方法。本研究建立的免疫学分析方法可以对GCA进行有效的检测,对肝功能的监控具有重要的意义。(本文来源于《广东工业大学》期刊2018-06-01）
李渊,徐黎明,赵景壮,刘淼,卢彤岩[2]（2016）在《抗传染性胰脏坏死病毒的重组单链抗体的流式细胞仪分选》一文中研究指出传染性胰腺坏死病是中国养殖鲑鱼的常见疾病。在这项研究中,将虹鳟的单链抗体库(scFv)和中国传染性胰脏坏死病毒(IPNV)Ch Rtm213株的病毒蛋白VP2通过细菌展示技术共表达。然后通过流式细胞术(FCM)进行IPNV特异性抗体的筛选。经过叁轮筛选,利用随机挑选单菌落的方法,获得了2株具有不同的荧光强度(MFI)的单链抗体克隆。将IPNV特异性的scFv抗体进行体外克隆、表达和纯化。结果显示纯化的抗体能够成功应用于Western印迹,酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光抗体试验(IFAT)。本研究提供了一种通过流式细胞仪高通量筛选抗体库的技术,通过该技术筛选获得的抗IPNV单链抗体可作为中国现行IPNV毒株的潜在的检测试剂。(本文来源于《2016年中国水产学会学术年会论文摘要集》期刊2016-11-02）
胡卫国[3]（2015）在《表达重组单链抗体片段（ScFv）E.coli发酵过程中高温胁迫与细胞自溶的关联研究》一文中研究指出重组细菌外源蛋白表达过程中的细胞自溶现象是一个普遍性的过程工程问题。本文以表达全人源化单链抗体片段Sc Fv的E.coli为出发菌种,5L生物反应器水平中的既定细胞培养过程(30oC,p H 7.0,溶氧30%)为模型,在σE介导的细菌细胞自溶途径基础上,通过研究工程菌细胞中Sc Fv表达和诱导前后施加高温胁迫(42oC,1.5 h)对活着但不可培养细胞(Viable but nonculturable cell,VBNC)的数目、E.coli细胞内胁迫应激途径基因表达水平及可溶性Sc Fv含量的影响,了解E.coli工程菌中Sc Fv表达、诱导前后的高温胁迫与细胞自溶发生时机及自溶程度的关联性。本文主要实验结果如下:(1)本论文前期开展的两水平因素实验结果及显着性分析表明温度及温度与其他因素的交叉影响作用对细胞自溶程度影响极其显着。摇瓶水平培养温度、温度与其他因素交叉影响作用、起始p H与自溶程度呈负相关性,IPTG浓度、转速及此两因素间交叉作用与自溶程度呈正相关性,为后期研究高温胁迫与细胞自溶关联性提供依据。(2)E.coli W3110工程菌中Sc Fv的表达可引起细胞内热胁迫应激途径的rpo H、dna K、dna J、gro ES、gro EL,酸胁迫途径的rpo S、gad E、gad X及氧胁迫应激途径的sod A、kat E的m RNA表达水平升高,多重胁迫应激反应的提前启动,大部分细胞提前进入VBNC状态,细胞自溶较野生菌细胞提前发生6 h;可培养状态细胞在Sc Fv表达后呈数量级降低,而在细胞自溶阶段发生自溶的主要为VBNC状态的细胞;自溶阶段自溶途径中外膜蛋白Omp A、Omp C、Omp X等重要结构蛋白基因量减少,而rpo E并未出现持续高表达。(3)生物反应器中诱导前和诱导后的E.coli W3110工程菌经受高温胁迫后,细胞自溶分别较未受高温胁迫的对照组提前6 h和1.5 h进入VBNC状态,进而在高温胁迫和Sc Fv表达的双重胁迫下,VBNC细胞自溶提前发生,且诱导前高温胁迫较诱导后高温胁迫的细胞自溶更早,自溶程度更深。在生物反应器中E.coli W3110工程菌诱导后的高温胁迫致使E.coli W3110工程菌可溶性Sc Fv比生产速率提前下降,最高Sc Fv含量仅为对照组的59.3%。诱导前发生的高温胁迫对于后期细胞内胁迫应激能力的影响较诱导后发生的高温胁迫影响更大,细胞自溶过程中外膜蛋白大量缺失。(本文来源于《江南大学》期刊2015-06-01）
何光志,王文佳,田维毅,王平,奚锦[4]（2012）在《抗重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库的构建及筛选》一文中研究指出为了构建重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库,试验用重组蛋白AD41抗原免疫接种Balb/c小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以总RNA为模板经RT-PCR合成cDNA,再以cDNA为模板,用小鼠免疫球蛋白重链和轻链设计引物,分别扩增重链和轻链可变区基因,利用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成单链抗体(ScFv)片段,将其克隆入质粒表达载体pCANTAB5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库。结果表明:从30个噬菌体克隆中筛选到25个阳性克隆。说明成功地构建了抗重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库。(本文来源于《黑龙江畜牧兽医》期刊2012年03期）
罗义辉[5]（2011）在《杀螟硫磷重组单链抗体研究》一文中研究指出基因工程抗体(genetically engeering antibody)是人们利用基因重组技术,在基因水平上对抗体分子进行有目的切割、拼接、修饰,或直接进行基因序列合成,再将重组基因导入受体细胞表达产生出的一类抗体。其中单链抗体(singe-chain variable fragment,ScFv)已被广泛应用于医学领域,因为它具有低或无免疫原性、组织穿透力强、相对分子质量小、可大规模生产等特点。单链抗体制备方法有核糖体展示技术和噬菌体展示技术等。其中核糖体展示技术由于具有库容量远比噬菌体展示文库大、完全在体外进行、建库和筛选方法简便等优点,并且还可通过突变或重组技术来提高重组抗体的亲和力,因而显示出了诱人的发展前景。有机磷农药(Organophosphorus pesticides)是我国目前在农业生产上使用较多的一类化学农药,农产品上有机磷农药的残留直接危害人们身体健康。必须对农产品中的有机磷残留进行严格检测。目前对这类农药的残留分析一般采用气相色谱法等仪器分析法检测。但这些方法必须对样品进行复杂的纯化处理,且操作者必须经过严格的专业培训,不适合现场操作。近年来,被广泛用于小分子化合物定量分析的免疫分析法为有机磷农药残留的快速检测提供了可能,获得高亲和力和高特异性且廉价的抗体是免疫分析操作的关键,目前还没有应用核糖体展示技术制备抗有机磷的高亲和力单链抗体的报道。本研究利用核糖体展示技术筛选具有高亲和力和高特异性的抗杀螟硫磷的重组单克隆抗体。本研究用杀螟硫磷-BSA免疫BALB/c小鼠,构建了抗杀螟硫磷单链抗体文库,用杀螟硫磷-OVA作为筛选抗原,应用核糖体展示技术筛选特异于杀螟硫磷的单链抗体,然后将筛选的单链抗体基因表达、纯化,并研究其特异性与亲和力。制备的重组单链抗体为杀螟硫磷的快速检测奠定了基础,该单链抗体可用于杀螟硫磷的ELISA(酶联免疫分析)检测,也可用于杀螟硫磷的免疫传感器的制备。主要研究结果如下:①用重氮化法分别合成了免疫抗原杀螟硫磷-BSA和筛选抗原杀螟硫磷-OVA。②利用杀螟硫磷-BSA免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右,符合建库要求。③提取小鼠脾细胞RNA,经RT-PCR构建的单链抗体文库轻链为700bp左右,重链为400bp左右,经连接肽连接后所得到的单链抗体大小约为1.1kb。测序结果表明,单链抗体序列为开放阅读框。它们的的互补决定区都互不相同,说明所构建的ScFv文库多样性好,可进行下一步的单链抗体的筛选。④将构建的ScFv文库经体外转录/翻译后,产生了叁元复合体(单链抗体-核糖体-mRNA,ARM)文库。用杀螟硫磷-OVA对产生的ARM叁元复合体进行亲和筛选,洗涤后,使保留的叁元复合体解离,再对释放的mRNA进行RT-PCR扩增获得筛选后的ScFv DNA文库,重复上述过程,得到经叁轮筛选后的ScFv DNA文库。⑤将原始ScFv文库DNA和经过叁轮筛选的ScFv文库DNA分别与噬菌体表达载体pPOW3.0相连接后,转入大肠杆菌DH5α中表达。然后后用间接ELISA分析单链抗体与杀螟硫磷-OVA的结合活性。结果表明从原始ScFv文库中随机挑取的50个克隆子的表达产物与杀螟硫磷-OVA几乎没有结合能力;而从经过叁轮筛选后的ScFv文库中挑取的100个克隆子中有25%与杀螟硫磷-OVA有较好的结合能力。从叁轮筛选后的ScFv文库中共挑取了190个克隆子,用间接ELISA法初筛到50株抗原阳性的ScFv。然后用生物传感技术对ELISA筛选呈阳性的ScFv进行了复筛,获得了3株高亲和力的单链抗体(ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132),用于下一步的表达、纯化和分析。⑥将筛选的抗原阳性ScFv进行了特性研究。单链抗体(ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132)特异性强、亲和力高。杀螟硫磷对它们的IC50分别为1.6、3.4和2.2 ng/ ml,检测限分别是0.02、0.07和0.01 ng/ml。它们与其它有机磷(甲基对硫磷、乙酰甲胺磷、马拉硫磷、乐果、叁唑磷、毒死蜱)交叉反应低,除了与甲基对硫磷有一定的交叉反应(≤2.8%),其余的均小于0.1%。Biacore分析其亲和力表明,单链抗体ScFv-AF50、ScFv-AF93和ScFv-AF132的解离平衡常数分别为4.56×10-10 M、1.42×10-9 M和2.66×10-10 M。⑦分析了ScFv基因的序列特征。IMGT(international immunogenetics database)软件分析单链抗体DNA序列,表明单链抗体scFv-AF50和AF132重链属于VH4基因家簇, scFv-AF93重链属于VH1基因家簇;叁株单链抗体的轻链均属于Vk IV亚基因家簇。序列同源性通过basic local alignment search tool (BLAST)软件分析,表明scFv-AF50和AF93重链有97%的同源性,scFv-AF50和AF132轻链有89%的同源性。⑧以我们筛选的ScFv-AF132为抗体蛋白,以竞争ELISA进行了稻米和黄瓜中杀螟硫磷的添加回收率的实验,并与气相色谱进行了比较,ELISA法的回收率在80.6%-108%之间,而GC法则在64%-91%之间,两方法的相对误差无明显差异。(本文来源于《重庆大学》期刊2011-10-01）
王弘,刘细霞,梁艳,张宏斌,孙远明[6]（2009）在《原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究》一文中研究指出目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鉴定重组抗体特性。方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体。以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性。超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白。通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western blotting和间接竞争ELISA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定。结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%。以1mol/L尿素洗涤包涵体,6mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%。Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应。间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应。结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础。(本文来源于《中国食品学报》期刊2009年04期）
陈刚[7]（2008）在《柑桔溃疡病菌重组单链抗体的高效表达及稳定性改造》一文中研究指出柑桔溃疡病(citrus bacterial canker disease, CBCD)是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病害,其病原菌为地毯草黄单胞柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. citri),是国内外重大检疫性有害生物。长期以来由于缺乏抗病品种和特效的化学防治药剂,对该病的防治主要采取加强非疫区建设与植物检疫来严防病害的传播,对病树采取挖除并集中烧毁的根除措施。目前国内外正在实施的柑桔非疫生产区建设,强化植物检疫,严防疫害传入的监控策略,迫切需要建立快速、特异、准确的诊断技术及防控措施。基因工程重组单克隆抗体(recombination monoclonal antibody, RMA)是90年代以来,人们利用基因工程重组技术,有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰,或者直接合成基因序列,再将重组DNA或重组蛋白基因导入细胞表达产生的一类抗体,兼具治疗和诊断双重功能。利用抗原-抗体特异性结合原理,可用于人类疾病、植物病害的诊断、治疗和预防。单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)是利用基因工程的方法用一连接肽将抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)拼接在一起的重组蛋白,由于其低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强,成本低,可大规模生产等特点已广泛应用于医学领域。但是,国内外单链抗体ScFv应用于植物病害方面的研究报道寥寥无几,且抗柑桔溃疡病菌的重组基因工程抗体高表达体系的建立以及稳定性改造方面的研究尚未见报道。本研究的目的就是针对现有的柑桔溃疡病快速检测技术体系尚未完善,并且传统上柑桔溃疡病的检测方法如PCR,噬菌体检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)和斑点免疫结合法(DIA)等在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高,不能很好的满足检疫工作的要求的缺点,应用高产重组单链抗体结合胶体金技术为柑桔溃疡病菌XAC的免疫诊断和防治研究提供新的工具和途径。研究内容主要包括:运用PCR方法扩增利用核糖体展示技术筛选的抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri, XAC)的单链抗体(ScFv 95)基因片段,将单链抗体基因重组到原核表达载体pET30a(+)中,构建单链抗体高效表达载体pET30a(+)-XAC-ScFv。再将pET30a(+)-XAC-ScFv质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,并对表达产物进行纯化、复性及活性检测,随后对抗体的稳定性进行初步改造从而为柑橘溃疡病菌的血清学诊断提供新型的诊断试剂,而且还可用于进一步研究柑橘溃疡病菌与寄主的初步识别机制,为柑橘溃疡病菌的生物防治提供理论依据。论文主要研究结果如下:①成功扩增抗柑桔溃疡病菌的单链抗体ScFv基因,将其进行酶切后与载体pET30a(+)相连并转化进了大肠杆菌BL21(DE3)中。②采用IPTG诱导的包涵体表达方式进行抗体的表达,将包涵体裂解物进行SDS-PAGE电泳,显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物采用His-tag蛋白纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE显示,在32 kDa同样有一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白,将表达产物进行了Western blot杂交,结果显示,与纯化后的电泳结果一致,在32 kDa处有单一的条带产生,说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。③采用凝胶(Sephacryl-200HR)柱上在位复性对蛋白进行活性再生,通过斑点杂交检测复性后蛋白的活性,结果显示蛋白通过凝胶层析复性已成功获得原有的生物功能。提取柑橘溃疡病菌LPS及柑橘溃疡病菌近源种甘蓝黑腐病菌(XCC)LPS、水稻条斑病菌(XOO)LPS、水稻白叶枯(XOOc)LPS,LPS用HEPPES缓冲液(10 mmol/L HEPES,100 mmol/L NaCL pH 7.4)稀释成5μg/ml,以30μL/min注入。用Biacore evauation软件分析单链抗体亲和力,分析结果显示复性后的重组抗体只跟柑橘溃疡病菌LPS具有较高的结合力,亲和常数KA(ka / kd)达到了2.72×10~7 M~(-1)。④通过重迭延伸PCR成功将半胱氨酸引入到了ScFv基因的VH和VL链中,为构建抗柑橘溃疡病菌的稳定型重组单链抗体的后续工作做了充足的准备。(本文来源于《重庆大学》期刊2008-04-01）
王宏,陈丹,邓宁,向军俭,靳英杰[8]（2007）在《抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达》一文中研究指出目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达。方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重迭延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGFscFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2007年12期）
陈刚,殷幼平,袁青,夏玉先,王中康[9]（2007）在《柑桔溃疡病菌重组单链抗体的高效表达及活性检测》一文中研究指出运用PCR方法扩增利用核糖体展示技术筛选的抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,XAC)的单链抗体(ScFv95)基因片段,将单链抗体基因重组到原核表达载体pET30a(+)中,构建单链抗体高效表达载体pET30a(+)-XAC-ScFv。再将pET30a(+)-XAC-ScFv质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,并对表达产物进行纯化、复性及活性检测。获得了抗XAC单链抗体的高效表达蛋白,以包涵体形式存在的表达蛋白大小约32kDa。包涵体蛋白经过变性、纯化和复性后,初步获得有功能的单链抗体。同时用Biacore分析XAC-ScFv-95与XAC LPS作用,结果表明复性后的XAC-ScFv-95具有较高的亲和力,从而为柑桔溃疡病菌XAC的免疫诊断和防治研究提供了新的工具和途径。(本文来源于《微生物学报》期刊2007年06期）
袁青[10]（2007）在《柑橘溃疡病菌重组单链抗体研究》一文中研究指出基因工程重组单克隆抗体(recombination monoclonal antibody, RMA)是90年代以来,人们利用基因工程重组技术,有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰,或者直接合成基因序列,再将重组DNA或重组蛋白基因导入细胞表达产生的一类抗体,其化学结构特点与单克隆抗体相同,具有稳定的免疫特异性。其中单链抗体(singe chain variable fragment,ScFv)由于低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强,成本低,可大规模生产等特点已广泛应用于医学领域。单链抗体可以通过噬菌体展示技术或核糖体展示技术加以制备。其中,核糖体展示技术完全在体外进行,其库容量远远大于噬菌体展示文库,此外核糖体展示技术简便的建库和筛选方法,勿需选择压力,通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点都使核糖体展示技术显示出了诱人的发展前景。国内外关于植物病原菌重组抗体的研究鲜见报道。只有少数应用噬菌体展示文库筛选了几种植物病原菌单链抗体,并将其应用于诊断研究中。至今无应用核糖体展示技术筛选植物病原菌单链重组抗体的报道。柑桔溃疡病(citrus bacterial canker disease, CBCD)是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病害,其病原菌为地毯草黄单胞柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. citri),是国内外重大检疫性有害生物。因抗病品种和特效药剂缺乏,美国、巴西等主要柑桔种植大国对柑桔溃疡病仍然沿用挖除病树集中烧毁的根除方法。目前我国正在实施的柑桔非疫生产区建设,强化植物检疫,严防疫害传入的监控策略,都迫切需要建立快速、特异、准确的诊断技术及防控措施。柑橘黄单孢菌(Xac)其细胞外有一层脂多糖(LPS),其有助于菌体吸附和吸收养分,增强病菌的抗逆能力,已经证实这些胞外多糖和糖蛋白是影响寄主与病原物接触识别或抑制识别和致病的生化因子。在病原菌与寄主表面接触时,识别作用决定了寄主-病原物互作性质。LPS由类脂A、核心多糖和O特异性多糖侧链(O特异性LPS)组成。其中O特异性LPS决定病原菌的种属特异性。本研究应用核糖体展示技术建立抗柑橘溃疡病菌单链抗体文库,用O特异性LPS作为抗原筛选特异于柑橘溃疡病菌的单链抗体,并将筛选的单链抗体进行表达、纯化、研究其亲和力及特异性。本研究筛选的单链抗体可为柑橘溃疡病菌的血清学诊断提供诊断试剂,而且还可用于进一步研究柑橘溃疡病菌与寄主的初步识别机制,为柑橘溃疡病菌的生物防治提供理论依据。其主要研究结果如下:①利用柑橘溃疡病菌细胞悬浮液免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠抗血清效价为2500倍左右,符合建库要求。②提取小鼠脾细胞mRNA,构建的单链抗体文库重链大小为350bp左右,轻链为650bp左右,经linker (Gly3Ser)4连接后单链抗体大小为1.2kb左右。将单链抗体文库DNA克隆到大肠杆菌JM109中,随机挑选了9个克隆子测序表明,9条单链抗体序列都是开放阅读框,其重链分别属于VH1、VH2、VH3基因家簇,轻链属于VKⅠ、VKⅢ、VKⅣ亚基因家簇。每个单链抗体的互补决定区(CDRs)都为不同的CDR,其中氨基酸序列变化多样,说明构建的单链抗体文库多样性好,适合于进一步进行单链抗体的筛选。③将构建的单链抗体文库进行体外转录和体外翻译后,产生了单链抗体-核糖体-mRNA(ARM)叁联复合体文库。用柑橘溃疡病菌O特异性脂多糖亲和筛选翻译产生的ARM叁联复合体,洗涤后,将保留的ARM复合体解离,释放mRNA,并对mRNA进行了反转录PCR扩增得到筛选后的单链抗体DNA文库,然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程,得到反复筛选几轮的单链抗体DNA文库。结果显示第一轮核糖体展示后回收的mRNA量非常少,分光光度计已测不出其浓度,反转录RCR后,扩增得到的条带非常弱,说明在原始未筛选的抗体文库中,能与柑橘溃疡病菌O特异性脂多糖作用的单链抗体数量较少。经过叁轮筛选后,得到的mRNA量逐渐增多,经RT-PCR后,产生了比较亮的扩增条带。说明在核糖体展示过程中,抗原阳性的单链抗体得到了富集。④将未经过筛选的原始单链抗体文库DNA和经过叁轮筛选的单链抗体文库DNA与噬菌体表达载体pCANTAB5E相连接后,转入大肠杆菌TG1中小量表达。表达后用间接ELISA测定单链抗体与抗原的结合活性。结果表明从未经过筛选的原始单链抗体文库中随机挑取的60个克隆子表达产物与柑橘溃疡病菌O特异性脂多糖几乎没有结合能力;而从经过叁轮筛选后的单链抗体文库中挑取的60个克隆子中有30%与单链抗体有较好的结合能力。从叁轮筛选后的单链抗体文库中共挑取了180个克隆子,用间接ELISA法初筛到60株抗原阳性的单链抗体;然后用生物传感技术(biosensor, biacore)对筛选的抗原阳性的单链抗体进行了复筛,筛选了3株高亲和力的单链抗体(GX13、GX44和GX95)以用于下一步的表达鉴定。⑤将筛选的高亲和力抗原阳性的克隆子从大肠杆菌TG1中转入高表达菌株HB2151中进行可溶性表达。并优化了表达条件。优化的表达条件如下:将单链抗体单克隆子接种于5 ml 2×YTAG中,30℃250 r/min培养过夜;次日将1ml过夜培养液加入50 ml 2×YTAG (2×YT培养基中含2%葡萄糖,100μg/ml氨苄青霉素)中,30℃250 r/min培养至OD_(600)为0.6-0.8;3500 r/min离心20 min,弃去上清;50 ml 2×YTAI(2×YT培养基中含1 mM IPTG,100μg/ml氨苄青霉素)重悬沉淀,30℃250 r/min培养7 h;3500 r/min离心20 min,沉淀用0.5 ml冰冷的1×TES (0.2 M Tris–HCl [pH 8.0], 0.5 mM EDTA, 0.5 M sucrose)重悬,再加入0.75 ml冰冷的1/4×TES,Vortex重悬,冰上孵育30 min,高速离心l0 min,留取上清,-20℃保存,此上清中含有分泌至细胞周质中的(perplasmic extract)抗体。⑥单链抗体表达后,其表达产物主要集中于细胞周质提取物中,具有抗体活性。将浓缩的周质提取物进行SDS-PAGE电泳,显示在32 kDa处有一蛋白条带产生。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE显示,在32 kDa同样有一蛋白条带产生。为了进一步验证表达的蛋白即目的蛋白,将表达产物进行了Western blot杂交,结果显示,与纯化后的电泳结果一致,在32 kDa处有单一的条带产生,说明表达纯化的蛋白即目的蛋白。⑦将筛选的抗原阳性单链抗体进行了特性研究。单链抗体(GX95、GX44、GX13)特异性强、亲和力高。其与柑橘溃疡病菌近源种Xanthomonas. oryzae pv. oryzae (Xooc); Xanthomonas. campestris pv. campestri (Xcc); Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola (Xoc);及从柑橘叶片上分离的10种腐生黄单孢菌及Bacillus subtilis; E. coli都没有交叉反应。Biacore分析其亲和力表明,单链抗体GX95、GX44和GX13的亲和常数分别为1.98×10~(10) M~(-1)、1.89×10~(10) M~(-1)、3.43×10~(10) M~(-1)。⑧对筛选的单链抗体进行了测序。用DNAplot软件分析单链抗体序列,结果表明:单链抗体GX44和GX13重链分别属于VH1基因家簇,GX95重链属于VH3基因家簇;GX44和GX13轻链属于Vk IV亚基因家簇,GX95轻链属于Vk III亚基因家簇。用Vector NTI软件对筛选的单链抗体的序列同源性进行了分析,表明GX44和GX13重链有89.67%的同源性,GX95和GX13具有92.53%的同源性。(本文来源于《重庆大学》期刊2007-04-01）
抗重组单链抗体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
传染性胰腺坏死病是中国养殖鲑鱼的常见疾病。在这项研究中,将虹鳟的单链抗体库(scFv)和中国传染性胰脏坏死病毒(IPNV)Ch Rtm213株的病毒蛋白VP2通过细菌展示技术共表达。然后通过流式细胞术(FCM)进行IPNV特异性抗体的筛选。经过叁轮筛选,利用随机挑选单菌落的方法,获得了2株具有不同的荧光强度(MFI)的单链抗体克隆。将IPNV特异性的scFv抗体进行体外克隆、表达和纯化。结果显示纯化的抗体能够成功应用于Western印迹,酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光抗体试验(IFAT)。本研究提供了一种通过流式细胞仪高通量筛选抗体库的技术,通过该技术筛选获得的抗IPNV单链抗体可作为中国现行IPNV毒株的潜在的检测试剂。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
抗重组单链抗体论文参考文献
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