圆红冬孢酵母DNA断裂修复机制调控

论文摘要

圆红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）可在胞内积累油脂、类胡萝卜素等,具有巨大的工业应用潜力。目前已经获得了R.toruloides的多组学信息,建立了基于农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）和电击转化（Electroporation transformation）的R.toruloides遗传操作方法。这为改善R.toruloides的生产性状,优化其代谢通路,建立有效的遗传操作系统提供依据。R.toruloides可以利用自身DNA断裂修复机制来进行基因编辑,然而R.toruloides的非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）机制占主导地位,同源性重组修复（Homologous recombination,HR）机制效率极低,难以通过同源重组的方式进行靶基因的定点敲除。针对以上问题,本论文尝试通过对R.toruloides中非同源末端连接机制关键基因KU70进行基因敲降或敲除,并过表达同源重组机制关键蛋白Rad52,从而弱化R.toruloides的非同源末端连接机制,提高同源重组效率,达到调控DNA断裂修复机制的目的。主要研究内容及成果如下:本论文利用RNA干扰（RNAi）方法对R.toruloides单倍体菌株NP11的非同源末端连接机制关键基因KU70进行敲降,获得了9株ku70-RNAi工程菌株。经RT-PCR分析发现,8株ku70-RNAi工程菌株中KU70基因在转录水平显著降低。以ku70-RNAi为出发菌株,利用电击转化方法分别导入CRT和MET15基因敲除盒,得到了CRT基因敲除工程菌株;其中,CRT基因敲除白色菌株,表达CRT基因可回补颜色表型。说明ku70-RNAi菌株的同源重组效率提高。同时,构建了不同靶位点的KU70敲除载体,利用CRISPR-cas9系统,对NP11的KU70基因进行敲除,获得了1株KU70碱基缺失35 bp的工程菌株（?KU70（1005 bp–1039 bp）,ku70-）。以ku70-为出发菌株,通过电击转化分别导入URA5和MET15基因敲除盒,得到表型正确的工程菌株。以上工作和课题组建立起的CRISPR-Cas9编辑技术配合使用,将对圆红冬孢酵母代谢通路调控和合成生物学研究具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 主要缩写表
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 圆红冬孢酵母概述
•   1.3 圆红冬孢酵母研究进展
•   1.4 基因编辑和基因表达调控技术
•     1.4.1 同源重组技术
•     1.4.2 RNAi技术
•     1.4.3 CRISPR/Cas9 技术
•   1.5 研究目的和意义
• 第二章 ku70-RNAi菌株的构建及应用
•   2.1 前言
•   2.2 材料与设备
•     2.2.1 菌株与质粒
•     2.2.2 培养基和相关溶液
•     2.2.3 主要试剂及耗材
•     2.2.4 主要仪器和设备
•     2.2.5 本章所用引物
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 ku70-RNAi载体的构建策略
•     2.3.2 ku70-RNAi载体转化大肠杆菌DH5α
•     2.3.3 ku70-RNAi重组载体的验证
•       2.3.3.1 方法一构建ku70-RNAi重组载体的验证
•       2.3.3.2 方法二构建ku70-RNAi重组载体的验证
•     2.3.4 ku70-RNAi重组载体农杆菌转化及验证
•     2.3.5 农杆菌介导转化
•     2.3.6 工程菌株的g DNA提取及PCR验证
•     2.3.7 工程菌株的总RNA提取及反转录PCR（RT-PCR）验证
•     2.3.8 ku70-RNAi工程菌株的应用
•       2.3.8.1 CRT敲除载体的构建
•       2.3.8.2 圆红冬孢酵母的电击转化
•       2.3.8.3 工程菌株的g DNA提取及PCR验证
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 ku70-RNAi载体的构建
•       2.4.1.1 方法一构建ku70-RNAi重组载体的验证
•       2.4.1.2 方法二构建ku70-RNAi重组载体的验证
•     2.4.2 ku70-RNAi农杆菌工程菌株的构建
•     2.4.3 ku70-RNAi圆红冬孢酵母工程菌株的构建
•       2.4.3.1 工程菌株遗传稳定性分析
•       2.4.3.2 工程菌株基因型鉴定
•       2.4.3.3 工程菌株的RT-PCR验证
•     2.4.4 ku70-RNAi工程菌株的应用
•       2.4.4.1 CRT敲除菌株的构建
•       2.4.4.2 MET15 敲除菌株的构建
•       2.4.4.3 URA5 敲除菌株的构建
•   2.5 本章小结
• 第三章 ku70-菌株的构建及应用
•   3.1 前言
•   3.2 材料与设备
•     3.2.1 菌株与质粒
•     3.2.2 培养基和相关溶液
•     3.2.3 主要试剂及耗材
•     3.2.4 主要仪器和设备
•     3.2.5 本章所用引物
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 KU70 敲除载体的构建
•     3.3.2 KU70 敲除载体转化农杆菌菌落PCR鉴定
•     3.3.3 圆红冬孢红酵母的转化
•     3.3.4 工程菌株的g DNA提取及PCR验证
•     3.3.5 ku70-菌株的应用
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 KU70 敲除载体的构建
•     3.4.2 KU70 敲除农杆菌工程菌株的构建
•     3.4.3 KU70 敲除圆红冬孢酵母工程菌株的构建
•       3.4.3.1 工程菌株遗传稳定性分析
•       3.4.3.2 工程菌株基因型鉴定
•     3.4.4 ku70-菌株的应用
•   3.5 本章小结
• 第四章 过表达Rad52 菌株的构建
•   4.1 前言
•   4.2 材料与设备
•     4.2.1 菌株与质粒
•     4.2.2 培养基和相关溶液
•     4.2.3 主要试剂及耗材
•     4.2.4 主要仪器和设备
•     4.2.5 本章所用引物
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 双表达盒组成型启动子过表达Rad52 菌株的构建
•       4.3.1.1 双表达盒组成型启动子过表达Rad52 载体的构建
•       4.3.1.2 双表达盒组成型启动子过表达Rad52 载体转化大肠杆菌
•       4.3.1.3 双表达盒组成型启动子过表达Rad52 载体转化农杆菌
•       4.3.1.4 圆红冬孢红酵母的转化
•       4.3.1.5 工程菌株的g DNA提取及PCR验证
•       4.3.1.6 工程菌株蛋白翻译水平的表达
•     4.3.2 单表达盒2A连接过表达Rad52 菌株的构建
•       4.3.2.1 单表达盒2A连接过表达Rad52 载体构建
•       4.3.2.2 单表达盒2A连接过表达Rad52 载体转化大肠杆菌
•       4.3.2.3 单表达盒2A连接过表达Rad52 载体转化农杆菌
•       4.3.2.4 圆红冬孢酵母的转化
•       4.3.2.5 工程菌株的g DNA提取及PCR验证
•       4.3.2.6 工程菌株蛋白翻译水平的表达
•     4.3.3 双表达盒诱导型启动子过表达Rad52 菌株的构建
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 双表达盒组成型启动子过表达Rad52 菌株的构建
•       4.4.1.1 双表达盒组成型启动子过表达Rad52 载体的构建
•       4.4.1.2 双表达盒组成型启动子过表达Rad52 农杆菌工程菌的构建
•       4.4.1.3 工程菌株遗传稳定性分析
•       4.4.1.4 工程菌株的g DNA提取及PCR验证
•       4.4.1.5 工程菌株蛋白翻译水平的表达
•     4.4.2 单表达盒2A连接过表达Rad52 菌株的构建
•       4.4.2.1 单表达盒2A连接过表达Rad52 载体的构建
•       4.4.2.2 单表达盒2A连接过表达Rad52 农杆菌工程菌株的构建
•       4.4.2.3 工程菌株遗传稳定性分析
•       4.4.2.4 工程菌株的g DNA提取及验证
•       4.4.2.5 工程菌株蛋白翻译水平的表达
•     4.4.3 双表达盒诱导型启动子过表达Rad52 菌株的构建
•       4.4.3.1 双表达盒诱导型启动子过表达Rad52 载体的构建
•       4.4.3.2 双表达盒诱导型启动子过表达Rad52 农杆菌工程菌株的构建
•       4.4.3.3 工程菌株遗传稳定性分析
•   4.5 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 论文成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘香健

导师: 杨帆,张素芳

关键词: 圆红冬孢酵母,非同源末端连接,同源重组,基因敲除

来源: 大连工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 大连工业大学

分类号: Q78

DOI: 10.26992/d.cnki.gdlqc.2019.000060

总页数: 90

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