CNPs对细胞毒性CD8+T细胞的作用及其机制研究

论文摘要

背景:细胞毒性CD8+T细胞（Cytotoxic CD8+T cells,CTLs）在控制肿瘤和细胞内病原体（包括病毒和细胞内细菌）中发挥了关键作用。当遭遇抗原时,抗原特异性的CD8+T细胞在次级淋巴器官中被抗原提呈细胞所激活。活化的CD8+T细胞经过克隆增殖,会产生很多具有细胞溶解能力的效应细胞。随后,效应细胞陆续迁移到身体的各个角落,以清除感染的细胞和病原体。在清除感染细胞和病原体的过程中,CTL细胞产生了多种细胞因子和细胞杀伤效应分子。如今,癌症和慢性感染威胁着人们的健康。尽管用于肿瘤免疫治疗的过继性T细胞移植（adoptive T cell transfer,ACT）治疗取得了显着显著的进展,尤其是CAR-T细胞治疗获得了美国食品和药物管理局（FDA）的商业批准,但在治疗的过程中部分患者也出现了诸如细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome,CRS）和神经毒性等严重的毒副作用。因此寻找一种能够有效提高CTL细胞杀伤活性的有效方法,尤其是在体外,是一个迫切需要解决的问题。氧化铈纳米颗粒（Ceria nanoparticles,CNPs）目前被广泛的应用于生物学和医学领域。CNPs具有清除细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）和阻止ROS积聚的药理潜力。事实上,基于这些优秀的抗氧化活性,CNPs已被用于治疗各种与氧化应激有关的慢性疾病,如癌症、炎症、糖尿病、肥胖、心血管疾病、视网膜损伤和神经退化等。但CNPs对于免疫系统,尤其是CTL细胞的作用还没有相关报道。最近的文章报道指出,细胞内较低或是中等水平的ROS,可能通过促进NF-κb等信号通路的表达,从而增强免疫反应。基于NF-κb信号在CTL细胞中所起到的重要作用以及ROS和NF-κb信号之间的相关性,本实验探究了CNPs对细胞毒性CD8+T细胞的作用及其机制。为有效提高CTL细胞杀伤活性提供了新的思路和方法。方法:1.检测CNPs对CTL细胞存活和增殖的影响。通过细胞阴选得到C57BL/6J小鼠和P14小鼠中的CD8+T细胞。将阴选得到的CD8+T细胞和不同浓度的CNPs（0,10μM,100μM,500μM,和1000μM）共同培养,用Annexin V/7-AAD染色检测CNPs对于CTL细胞是否含有细胞毒性。通过CFSE染色和Ki-67染色检测CNPs对于CTL细胞增殖的影响。2.检测CNPs对CTL细胞的细胞因子产量和细胞杀伤效应分子分泌的影响。通过细胞阴选得到C57BL/6J小鼠和P14小鼠中的CD8+T细胞。将CD8+T细胞和不同浓度的CNPs（0,10μM,100μM）共同培养。通过细胞内蛋白染色检测CTL细胞在和CNPs共培养后,胞内IFN-γ,TNF-α,,IL-2,,granzyme B,perforin的含量。3.检测CNPs对CTL细胞在体内和体外特异性杀伤活性的影响。体外杀伤活性通过体外杀伤实验进行探究,体内杀伤实验通过RT-qPCR技术检测不同组织器官内的LCMV病毒滴度进行探究。4.检测CNPs处理后CTL细胞内ROS及MMP水平,NF-κb信号通路相关蛋白的表达。通过DCFDA Cellular ROS Detection试剂盒和Mitochondria Staining试剂盒分别检测ROS和MMP水平。通过WB技术检测β-actin,IκBα,Phospho-IκBα,IKKβ蛋白的表达。5.抑制NF-κb信号通路中相关分子的表达后,CTL细胞功能变化的探究。利用IKKβ的抑制剂IMD-0354来阻断NF-κb信号通路中IκBα蛋白的磷酸化。检测NF-κb信号通路被抑制后,CTL细胞功能的变化。结果:1.在CNPs处理后,各浓度组CD8+T细胞的增殖和凋亡没有显著性的区别。说明CNPs对CTL细胞的存活和增殖没有影响。2.在CNPs处理后,CTL细胞产生的细胞因子和分泌的细胞杀伤效应分子较未处理组增多。说明了CNPs的处理也许增强了CTL细胞的特异性杀伤活性。3.从体内和体外的特异性杀伤实验中可以得出:在CNPs处理后,CTL细胞在体内和体外的特异性杀伤能力都增强了。4.CNPs通过降低CTL细胞的MMP水平从而降低了ROS的产量。而ROS产量的降低激活了NF-κB信号通路的表达。5.通过抑制NF-κB信号通路中相关分子的表达,CTL细胞的细胞因子和细胞杀伤效应分子的产量相应下降,从而降低了CTL的杀伤活性。结论:综上所述,CTL细胞经过CNPs处理之后降低了MMP的水平,进而降低了ROS的产量。CTL细胞内较低的ROS水平促进了NF-κB信号通路的表达,促进了细胞因子的产生和细胞杀伤效应分子的释放,并最终提高了CTL细胞对病毒,细胞内细菌和癌细胞的抗原特异性杀伤能力。我们的发现为诸如肿瘤免疫治疗等CNPs的临床应用提供了新思路,但CNPs在ACT中的治疗作用有待进一步的研究。

论文目录

• 缩略语表
• Abstract
• 中文摘要
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.实验结果
• 4.讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 文献综述 纳米材料在免疫治疗中的应用
•   参考文献
• 攻读硕士学位期间发表文章
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 唐舒沛

导师: 周新元

关键词: 氧化铈纳米颗粒,细胞,细胞毒性细胞,信号通路,病毒清除能力

来源: 中国人民解放军陆军军医大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国人民解放军陆军军医大学

分类号: R392.12

DOI: 10.27001/d.cnki.gtjyu.2019.000118

总页数: 55

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