小肠上皮组织外泌体提取与鉴定及功能研究

论文摘要

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外纳米级小囊泡,转运核酸（如微小RNA,mi RNA）、蛋白质和脂质等生物活性分子,进入受体细胞,调节受体细胞的表型和功能,因而,外泌体在细胞-细胞、组织-组织信息交流和调控中发挥至关重要的作用。肠道上皮是由单层细胞组成的表面积最大的器官,也是人体是最大的感受器。小肠内容物除了不断变化的各种饮食成分及其消化产物,更有各类繁多的菌群及其代谢产物,因而肠道的分泌调节功能是受到复杂的肠内容物,如食物、微生物等共同影响。正因为如此,对原代小肠上皮的体外研究目前只有通过3D类器官培养,才能反映肠道上皮细胞的体内特征,但这也无法体现上皮细胞某些特殊功能,尤其是分泌调节功能。因此为了真实体现外泌体的分泌调节作用,已开始进行不同模型下组织外泌体分泌研究,如功能复杂、细胞间相互影响、对外界环境刺激不断反应的脑组织已经采取了提取组织外泌体的方法。因而,同样的,我们在研究小肠上皮外泌体分泌时,应选择直接提取小肠上皮的外泌体。所以,我们创新性地进行小肠上皮组织分泌外泌体研究。使用该方法所提取的外泌体与其内脏脂肪细胞进行共培养,从而探究不同小肠上皮来源的外泌体对内脏脂肪细胞功能的影响。本研究分为两个部分:第一部分:小肠上皮组织外泌体的提取与鉴定第二部分:小肠上皮组织外泌体作用于内脏脂肪细胞的功能研究第一部分:小肠上皮组织外泌体的提取与鉴定目的:肠道上皮是由单层细胞组成的表面积最大的器官,也是人体是最大的感受器。小肠内容物除了不断变化的各种饮食成分及其消化产物,更有各类繁多的菌群及其代谢产物,因而肠道的分泌调节功能是受到复杂的肠内容物,如食物、微生物等共同影响。所以,反映真实的肠道上皮体内分泌调节功能是个挑战,为此,我们提出了从小肠上皮组织中提取外泌体的概念。方法:我们创新性的提出小肠上皮外泌体的提取方法。将3w雄性小鼠的小肠取下后去除掉粪便及肠道粘液,用EDTA将小肠的上皮层和黏膜层分开,低速离心后去除沉淀和细胞碎片,后再经过超速离心（100,000g）后获得小肠上皮组织来源的外泌体。我们对这种方法提取的外泌体经过了透射电镜、免疫蛋白印迹及纳米颗粒追踪分析技术的鉴定。结果:我们成功提取了3w雄性小鼠的外泌体,并且通过透射电镜观察到外泌体典型的双凹圆形结构;我们通过免疫蛋白印迹（western blotting）验证了几个外泌体特异性表面蛋白（CD63,HSP70,TSG101）的表达以及纳米颗粒追踪分析（NTA）展示了外泌体的大小及浓度。结论:我们成功的从小鼠的小肠上皮组织中提取了外泌体,并对外泌体的大小,形态,数量及表面标志性蛋白进行了一些列的分析,充分验证了我们提取外泌体的纯度。第二部分:小肠上皮组织外泌体作用于内脏脂肪细胞的功能研究目的:肠道上皮是机体能量稳态的中枢调节器官,对维持机体能量稳态对所起着至关重要的作用,机体代谢平衡涉及多个器官之间的共同协调作用。而肠道作为营养感受与吸收的首要器官,是机体能量稳态的中枢调节器官,其中最重要的是对储存能量的器官—脂肪的调节。因此,我们致力于探究在高脂饮食水平下肠道外泌体对脂肪功能的影响。方法:通过PKH26标记不同饮食小鼠小肠上皮外泌体,并使用高脂饮食小鼠的肠上皮外泌体刺激了内脏脂肪细胞并用PCR及western blotting检测其炎症、棕色化、脂肪功能的基因变化。结果:我们成功证明小肠上皮来源外泌体能够被内脏脂肪细胞所摄取。我们将所获取的正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠所提取的小肠上皮组织外泌体进行了高通量测序分析,结果显示在高脂饮食组有26个基因上调,同时有14个下调。此外,我们用15月龄雌性小鼠正常饮食组、高脂饮食组小鼠的小肠外泌体以未加外泌体组为参照,刺激了3w雄性小鼠的原代内脏脂肪细胞,结果显示高脂外泌体刺激组较正常饮食外泌体刺激组和未加外泌体组炎症基因表达均有明显升高,而正常饮食外泌体刺激组和未加外泌体刺激组之间没有明显的改变。结论:高脂饮食小鼠的肠上皮外泌体刺激原代内脏脂肪细胞产生炎症因子因子的变化,为我们进一步研究肠道来源的物质能够调控脂肪功能提供理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 小肠上皮组织外泌体的提取与鉴定
•   引言
•   材料与方法
•   研究结果
•   第一部分结果总结
• 第二部分 小肠上皮组织外泌体作用于内脏脂肪细胞的功能研究
•   引言
•   材料与方法
•   研究结果
•   第二部分结果总结
• 讨论
• 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 论文主要英文缩略语词表
• 攻读硕士学位期间发表文章
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 夏凡

导师: 丁国宪

关键词: 外泌体,小肠上皮,透射电镜,纳米颗粒追踪分析,高脂饮食,高通量测序分析

来源: 南京医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 南京医科大学

分类号: R333

总页数: 65

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