内含子、polyA对CHO细胞表达系统转基因表达的影响

论文摘要

背景目前,全世界治疗性重组蛋白（包括重组抗体）的生产近70%是用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞表达系统生产的。影响重组蛋白在CHO细胞中高效且稳定表达的因素很多,其中表达载体是其中最重要的因素之一。由于目的基因转入后的随机整合,以及基因沉默和不稳定表达的经常发生,限制了大规模工业化生产的发展。因此高效稳定表达载体的构建已经成为国内外学者研究的热点。目的探究不同内含子元件和polyA元件对CHO细胞转基因表达水平及稳定性的的影响及其机制。方法1.根据文献报道的内含子序列hCMV intron A（hCMVI）、TPL intron（TPLI）、SV40 intron（SVI）、CHEF1 gene intron1（CHEFI）,PCR扩增或人工合成内含子片段替换原表达载体pIRES-EGFP中内含子IVS,构建含不同内含子的表达载体。2.根据文献报道的polyA序列（BGH polyA、Mutation BGH polyA、Synthetic polyA、HSV TK polyA、SV40 late polyadenylation signal）,PCR扩增或人工合成polyA片段替换原表达载体pIRES-EGFP中的polyA,构建含不同polyA片段的表达载体。3.通过lip2000转染试剂将构建好的载体转染CHO-S细胞,48h后荧光显微镜下观察转染情况,流式细胞术检测其瞬时表达量和转染效率。4.细胞在加压下筛选稳定表达的克隆株,流式检测eGFP稳定表达。qPCR和RT-qPCR检测转基因拷贝数和mRNA表达。5.用阿达木抗体基因替换筛选出的高表达载体上的报告基因eGFP,构建含目的基因的表达载体转染CHO-S细胞,蛋白印迹法（Western Blot）检测阿达木抗体的表达。结果1.经酶切测序证明已成功构建重组载体。2.瞬时表达分析,与对照载体相比,内含子中的SV40内含子能够提高转染效率和瞬时表达（P<0.05）;而与对照载体相比BGH polyA和Syntion polyA能够显著提高转染效率和瞬时表达（P<0.05）。3.稳定表达分析,和对照载体相比,SV40内含子和hCMV内含子均能提高CHO细胞的转基因表达（P<0.05）;对调控元件ploy A,Synthetic polyA和SV40late polyA能显著提高CHO细胞的稳定转基因表达（P<0.05）。4.qPCR表明转基因表达量的高低与基因拷贝数无关。RT-qPCR检测eGFP的mRNA的表达,结果表明mRNA的表达量高低与目的基因的表达量亦不成正相关。5.Western blot检测结果表明,筛选的高表达载体在阿达木抗体中也可以提高表达。结论1.内含子中的SVI、hCMVI能够显著提高CHO细胞的转基因表达。2.PolyA中的Synthetic和SV40 late能够显著提高CHO细胞转基因表达。3.筛选的高表达载体也能提高阿达木抗体的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 含不同内含子的表达载体在CHO-S细胞中对转基因表达的影响
•   第一节 内含子对CHO细胞e GFP表达的影响
•     1 材料
•     2 方法
•     3 结果
•   第二节 内含子对重组抗体阿达木表达的影响
•     1 材料
•     2 方法
•     3 结果
• 第二章 不同polyA在 CHO细胞中对转基因表达的影响
•   第一节 不同polyA在 CHO对报告基因EGFP表达的影响
•     1 材料
•     2 方法
•     3 结果
•   第二节 polyA对重组抗体阿达木表达的影响
•     1 材料
•     2 方法
•     3 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 哺乳动物重组蛋白表达载体的优化
•   参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐丹华

导师: 王小引,王天云

关键词: 基因表达,内含子,中国仓鼠卵巢细胞,表达调控

来源: 新乡医学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 新乡医学院

分类号: Q78

DOI: 10.27434/d.cnki.gxxyc.2019.000174

总页数: 79

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