鸭源沙门菌流行特点及耐药特点分析

论文摘要

沙门菌是危害人类与畜禽健康的重要病原菌,有3000多种血清型。沙门菌病是各种动物由沙门菌属细菌引起的疾病总称。沙门菌可以与其它病原菌联合感染,对养殖业造成巨大经济损失。尤其对于规模化鸭场,一旦爆发鸭沙门菌病,可迅速传播蔓延,引起雏鸭大批量死亡。随着抗生素的广泛使用,沙门菌对抗生素耐药性不断增强并且加剧了多重耐药沙门菌的产生,对养鸭业构成极大的威胁。本研究旨在了解本地区鸭养殖场和屠宰场沙门菌的流行情况以及耐药特点。于2016年12月至2017年4月,从山东省泰安和济南地区养鸭场和屠宰场共采集2342份样品,通过培养基培养,PCR扩增分离鉴定沙门菌。进而通过平板凝集试验确定沙门菌血清型,利用多位点序列分型技术（Multilocus sequence typing,MLST）和脉冲场凝胶电泳技术（Pulse-field gel electrophoresis,PFGE）确定沙门菌基因序列型,了解沙门菌分类特点以及沙门菌之间的亲缘关系;利用PCR技术检测13种常见的毒力基因,了解沙门菌毒力基因特点;利用PCR技术检测25种耐药基因存在情况,利用PCR技术检测Ⅰ类整合子,了解其耐药基因盒的存在情况;利用药敏试验检测14种常用药物的耐药性,初步了解本地区鸭源沙门菌的耐药情况,为生产上合理用药提供理论依据。本研究共分离得到49株鸭源沙门菌,血清分型共分为6种血清型,其中最为流行的血清型是肠炎沙门菌（40.82%）,其次是鸭沙门菌占20.41%,鼠伤寒沙门菌占16.33%,肯塔基沙门菌占10.20%,印第安纳沙门菌占10.20%,蒙得维的亚沙门菌占2.04%。MLST分型共分为7种ST型,其中最主要的ST型是ST11（40.82%）,其次是ST2441（20.41%）、ST19（12.24%）、ST17（10.20%）、ST198（10.20%）、ST1544（4.08%）、ST305（2.04%）。PFGE分型共分为39种PFGE图谱型、10个聚类簇,肠炎沙门菌和鸭沙门菌同源性较高,大多数位于同一聚类簇,表明肠炎沙门菌和鸭沙门菌可能分别由同一克隆系的沙门菌克隆传播。49株鸭源沙门菌进行13种毒力基因的检测,检出率最高的是invA（100%）、hilA（100%）和sipA（100%）毒力基因,其次是stnP1（91.8%）和ssrA（91.8%）毒力基因,检出率最低的是ssaR（16.3%）和sopE（16.3%）毒力基因。分离自养殖场1和屠宰场的沙门菌毒力基因检出率明显较低。利用纸片法检测49株鸭源沙门菌对14种抗生素（青霉素类、头孢类、氨基糖苷类等9类抗生素）的药物敏感情况,结果显示耐药率最高的是红霉素（100%）,其次是萘啶酸（95.92%）、氨苄西林（55.10%）和链霉素（55.10%）。其中13种抗生素均检测到不同程度的耐药性,仅多粘菌素B全部表现为药物敏感。多重耐药（MDR）沙门菌所占比例为71.43%。本研究中的印第安纳沙门菌耐药情况尤为严重,对9类抗生素中的78类抗生素耐药,对14种抗生素中的1213种抗生素耐药。此外,分离自养殖场1和屠宰场的沙门菌耐药情况明显较少。通过25种耐药基因检测,49株鸭源沙门菌检测出11种耐药基因。其中,耐药基因检出率最高的是blaTEM,占73.47%(blaTEM-1占61.23%,blaTEM-116占10.20%,blaTEM-181占2.04%),其次是sul2（28.57%）,未检测到四环素类和氯霉素类耐药基因。另外,9株沙门菌未检测到耐药基因,其中5株均来自养殖场1,分离自养殖场1和屠宰场的沙门菌所携带的耐药基因明显较少。49株沙门菌Ⅰ类整合子检出率为34.69%,携带的耐药基因盒主要是aadA7+aac3-ld（1.5kb,n=15）。此外,携带耐药基因盒的沙门菌其中94.12%（16/17）是多重耐药沙门菌,Ⅰ类整合子所携带的耐药基因盒可能与沙门菌耐药性有一定的相关性。本研究从多个方面分析研究了本地区鸭养殖场和屠宰场沙门菌特性,并且首次应用3种分型方法探讨了山东省不同养殖场流行的沙门菌之间的亲缘关系,对山东省不同鸭养殖场沙门菌进行了溯源分析,同时丰富了山东省鸭养殖场沙门菌的数据资料,探究了沙门菌的耐药特点,为养殖业临床用药提供理论依据,有助于沙门菌的防制。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
•   1.1 沙门菌病原学特征
•     1.1.1 沙门菌的形态特性
•     1.1.2 沙门菌的培养特性
•     1.1.3 沙门菌的血清学特性
•     1.1.4 沙门菌的致病性
•   1.2 沙门菌污染状况
•     1.2.1 鸭养殖场中沙门菌流行情况
•     1.2.2 鸭屠宰场中沙门菌流行情况
•   1.3 沙门菌对养殖业的危害
•   1.4 沙门菌的检测方法
•     1.4.1 常规检测方法
•     1.4.2 免疫学检测方法
•     1.4.3 核酸检测方法
•   1.5 沙门菌的分子分型方法
•     1.5.1 多位点基因序列分型（MLST）
•     1.5.2 脉冲场凝胶电泳（PFGE）
•   1.6 沙门菌的毒力基因
•     1.6.1 毒力岛
•     1.6.2 肠毒素
•     1.6.3 脂多糖
•   1.7 沙门菌的耐药机制
•     1.7.1 整合子介导的耐药机制
•     1.7.2 细菌的主动外排机制
•     1.7.3 药物作用靶位结构
•     1.7.4 细胞膜通透性的改变
•   1.8 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 样品来源
•     2.1.2 菌株
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 主要试剂和试剂配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 样品处理
•     2.2.2 沙门菌的分离鉴定
•     2.2.3 沙门菌的PCR鉴定
•       2.2.3.1 PCR扩增
•     2.2.4 沙门菌分离株的保存
•     2.2.5 沙门菌血清型的鉴定
•     2.2.6 沙门菌多位点序列分型（MLST）
•       2.2.6.1 MLST引物合成
•       2.2.6.2 细菌DNA的提取
•       2.2.6.3 PCR反应条件
•       2.2.6.4 PCR产物纯化
•       2.2.6.5 测序及测序结果分析
•     2.2.7 沙门菌脉冲场凝胶电泳（PFGE）
•       2.2.7.1 沙门菌的活化准备
•       2.2.7.2 沙门菌的包埋
•       2.2.7.3 胶块裂解
•       2.2.7.4 清洗胶块
•       2.2.7.5 胶块内DNA的酶切
•       2.2.7.6 加样以及电泳
•       2.2.7.7 电泳图像获取及分析
•       2.2.7.8 注意事项
•     2.2.8 沙门菌主要毒力基因的检测
•       2.2.8.1 毒力基因引物的合成
•       2.2.8.2 细菌DNA提取
•       2.2.8.3 PCR扩增
•     2.2.9 沙门菌药敏试验
•     2.2.10 沙门菌耐药基因的检测
•       2.2.10.1 耐药基因引物的合成
•       2.2.10.2 PCR反应条件
•       2.2.10.3 PCR产物纯化以及DNA序列测定
•     2.2.11 沙门菌Ⅰ类整合子的检测
•       2.2.11.1 Ⅰ类整合子引物的合成
•       2.2.11.2 PCR反应条件
•       2.2.11.3 PCR产物纯化以及DNA序列测定
• 3 结果与分析
•   3.1 沙门菌的鉴定结果
•     3.1.1 沙门菌的培养特性
•     3.1.2 沙门菌PCR鉴定结果
•   3.2 规模化鸭场和屠宰场中沙门菌的分离结果
•   3.3 沙门菌血清型分型结果
•   3.4 沙门菌MLST分型结果
•     3.4.1 沙门菌的7 对管家基因的PCR扩增结果
•     3.4.2 沙门菌MLST分型分析
•   3.5 沙门菌PFGE分型结果
•     3.5.1 沙门菌PFGE电泳结果
•     3.5.2 沙门菌PFGE分型分析
•     3.5.3 沙门菌血清分型、MLST分型和PFGE分型的结果分析
•   3.6 沙门菌毒力基因检测结果
•     3.6.1 沙门菌毒力基因PCR扩增结果
•     3.6.2 沙门菌毒力基因统计分析
•   3.7 沙门菌药敏试验结果
•     3.7.1 沙门菌药敏试验初步结果
•     3.7.2 沙门菌药敏试验统计分析
•     3.7.3 沙门菌多重耐药情况统计分析
•   3.8 沙门菌耐药基因检测结果
•     3.8.1 沙门菌耐药基因PCR扩增结果
•     3.8.2 沙门菌耐药基因的统计分析
•     3.8.3 沙门菌耐药基因与耐药表型相关性分析
•   3.9 沙门菌Ⅰ类整合子检测和基因盒特点
• 4 讨论
•   4.1 鸭养殖场中沙门菌的流行情况
•   4.2 沙门菌的血清分型、MLST分型和PFGE分型
•   4.3 沙门菌的毒力基因分析
•   4.4 沙门菌的耐药表型、耐药基因型和耐药基因盒分析
• 5 结论
• 6 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 硕士生期间的论文发表情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨杰

导师: 孙淑红

关键词: 沙门菌,血清型,多位点序列分型,脉冲场凝胶电泳,毒力基因,耐药性,耐药基因,类整合子

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家十三五重点研发计划项目:“肉种禽场沙门氏菌病综合防控技术集成于示范研究”(2016YFD0501608)

分类号: S852.61

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