Pantoea dispersa蔗糖异构酶在芽孢杆菌中的表达及发酵优化

论文摘要

蔗糖异构酶（Surcose Isomerase,SIase）能将蔗糖分子内的α-1,2-糖苷键转位形成α-1,6-糖苷键或α-1,1-糖苷键,从而得到异麦芽酮糖或海藻酮糖,根据其主产物不同也被称作异麦芽酮糖合酶或海藻酮糖合酶。异麦芽酮糖与蔗糖在甜度、溶解度等物理性质比较相近。相对于蔗糖而言,异麦芽酮糖具有防龋齿、预防糖尿病、抗疲劳、易吸收等特点。生物酶法制备异麦芽酮糖转化率较高,反应条件温和,产物易分离,符合绿色环保的要求。本研究基于前期构建的产蔗糖异构酶重组菌Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI,通过对摇瓶和3-L罐培养条件进行优化,并进一步筛选启动子提高了酶产量。同时将蔗糖异构酶基因在宿主菌Bacillus subtilis WSH11中进行表达,同时比较两个表达系统的优劣性。主要研究结果如下:（1）通过摇瓶优化,确定了重组菌B.choshinensis/pNCMO2-SI最佳培养条件为:葡萄糖10 g·L-1,多聚蛋白胨8.5 g·L-1,牛肉浸膏8.5 g·L-1,NH4H2PO4 2 g·L-1,重组菌经过摇瓶发酵48 h,测得胞外上清酶活为98.4 U·mL-1。进一步对3-L罐培养条件进行优化,确立了初始碳源为10 g·L-1葡萄糖,初始氮源为15 g·L-1多聚蛋白胨、15 g·L-1牛肉浸膏,发酵温度为30℃的发酵工艺。用上述条件进行重组菌的3-L罐发酵,当发酵进行35 h时,此时胞外上清酶活达到275 U·mL-1,是摇瓶优化后酶活的2.79倍。（2）为了进一步提高蔗糖异构酶的表达水平,探究了不同来源的启动子(枯草芽孢杆菌来源的启动子Papr、Pnpr、Pamy以及巨大芽孢杆菌来源的启动子Pxyl)对重组菌表达蔗糖异构酶的影响。通过摇瓶发酵获得最优启动子为Papr,其对应重组菌BCpNapr-SI经过TM培养基摇瓶发酵48 h测得胞外上清酶活为85.1 U·mL-1,其次为Pnpr、Pamy,对应重组菌分别是BCpNnpr-SI、BCpNamy-SI,对应胞外上清酶活为80 U·mL-1和73 U·mL-1。木糖启动子Pxyl介导的重组菌BCpNxyl-SI发酵48 h酶活最低,为38 U·mL-1。（3）对不同启动子重组菌发酵过程中氮源、添加剂等条件进行优化,确定了最优条件下的重组菌BCpNapr-SI、BCpNnpr-SI、BCpNamy-SI以及BCpNxyl-SI摇瓶发酵48 h后胞外上清酶活分别为137.0 U·mL-1、126.3 U·mL-1、110.6 U·mL-1和47 U·mL-1,分别是未优化摇瓶水平的1.61倍、1.58倍、1.52倍和1.23倍。基于上述实验结果,对含不同启动子重组菌进行3L罐发酵,其中启动子Papr介导的重组菌BCpNapr-SI在发酵52 h时,胞外上清酶活达到485.5 U·mL-1,是未优化前启动子的1.76倍。（4）分别以载体pHY300PLK-CGT和载体pBSMuL-LacZ为骨架,将蔗糖异构酶基因与其进行连接,构建重组质粒pHY300PLK-SI和pBSMuL-SI,将其分别转化枯草芽孢杆菌B.subtilis WSH11中得到重组菌BSpHY-SI和BSpBS-SI,在TB培养基中发酵48 h后测得胞外上清酶活分别为7.4 U·mL-1和10.7 U·mL-1。在摇瓶水平上对重组菌BSpBS-SI进行培养条件优化,结果表明最优培养条件为:豆粕粉16 g·L-1,鱼粉蛋白胨8 g·L-1,甘油8 g·L-1,Mg2+1 mM。在该条件下,33℃恒温发酵48 h后测得酶活为20.4 U·mL-1。基于上述发酵条件,对重组菌BSpBS-SI进行3-L发酵罐分析,补料培养基中葡萄糖150 g·L-1,豆粕粉100 g·L-1,鱼粉蛋白胨50 g·L-1,溶氧与转速偶联控制溶氧DO值为30%。当重组菌BSpBS-SI发酵75 h时,菌体生长浓度OD600达到115,此时胞外上清酶活达到209.5 U·mL-1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 蔗糖异构酶的概述
•     1.1.1 蔗糖异构酶的来源
•     1.1.2 蔗糖异构酶的酶学性质
•     1.1.3 蔗糖异构酶的制备
•   1.2 异麦芽酮糖的概述
•     1.2.1 异麦芽酮糖的理化性质
•     1.2.2 异麦芽酮糖的功能
•     1.2.3 异麦芽酮糖的生产
•   1.3 短短芽孢杆菌的概述
•   1.4 枯草芽孢杆菌的概述
•   1.5 立题依据与研究意义
•   1.6 主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 菌种及质粒
•   2.2 主要试剂
•   2.3 主要仪器
•   2.4 培养基
•   2.5 分子生物学操作
•     2.5.1 不同重组质粒的构建与鉴定
•     2.5.2 E.coli感受态细胞的制备及化学法转化
•     2.5.3 短短芽孢杆菌感受态的制备及电击转化
•     2.5.4 枯草芽孢杆菌感受态的制备及电击转化
•   2.6 发酵方法
•     2.6.1 不同重组短短芽孢杆菌的发酵培养
•     2.6.2 不同重组枯草芽孢杆菌的发酵培养
•   2.7 分析方法
•     2.7.1 细胞浓度的测定
•     2.7.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
•     2.7.3 SDS-PAGE分析
•     2.7.4 蔗糖异构酶的酶活测定
•     2.7.5 蛋白酶酶活的测定
•     2.7.6 蛋白浓度的测定
•     2.7.7 葡萄糖的测定
•     2.7.8 残氮的测定
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 重组菌B.choshinensis/pNCMO2-SI的发酵优化
•     3.1.1 重组菌B.choshinensis/pNCMO2-SI的摇瓶优化
•     3.1.2 重组菌B.choshinensis/pNCMO2-SI的3-L发酵罐优化
•   3.2 启动子对蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中重组表达的影响
•     3.2.1 含不同启动子重组表达质粒的构建与重组酶的表达
•     3.2.2 含不同启动子重组菌的摇瓶优化
•     3.2.3 含不同启动子重组菌的3-L罐发酵
•     3.2.4 重组短短芽孢杆菌发酵过程蛋白酶对酶活的影响分析
•   3.3 蔗糖异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
•     3.3.1 重组菌BSpBS-SI的构建与表达
•     3.3.2 重组菌BSpHY-SI的构建与表达
•     3.3.3 重组菌BSpBS-SI的发酵优化
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邹亮

导师: 陈晟

关键词: 蔗糖异构酶,短短芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,克隆表达,发酵优化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ925

总页数: 54

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