水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶（OsCKXs）基因家族成员定向突变体库构建及分析

论文摘要

水稻既是重要的粮食作物也是单子叶植物生物学研究的模式材料,随着水稻功能基因组学研究的深入及分子操作技术的成熟,有效解读水稻内源基因生物功能,进而进行有效的分子育种日益成为可能。细胞分裂素（cytokinin,CTK）是植物生长发育过程必不可少的激素成分,细胞分裂素氧化/脱氢酶（cytokinin oxidases/dehydrogenase,CKX）通过降解细胞分裂素,有效调控植物内源细胞分裂素水平,是细胞分裂素信号通路中降解分支的关键酶。水稻全基因组中注释了11个CKX基因,已有研究揭示了其中部分基因对水稻生长的调控作用,但因为缺乏明确的突变体材料,水稻OsCKX基因家族具体成员的生物功能所至有限。本文应用CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a基因组编辑技术,以日本晴为模式材料,针对OsCKX基因家族成员进行定向敲除,创制OsCKX1OsCKX11单基因及多基因定向敲除突变体材料,为系统研究OsCKX基因家族不同成员生物功能及有效进行分子育种奠定基础。本文主要研究内容及结果如下:1.基于CRISPR-Cas9核酸酶编辑系统向导RNA（single guide RNA,sgRNA）设计标准,针对OsCKX1OsCKX11基因编码区扫描5’-NGG-3’三核苷酸PAM位点,选取PAM上游20 bp DNA序列作为sgRNA识别区域,构建OsCKX1OsCKX11定向敲除编辑载体,进而基于农杆菌介导的遗传转化导入水稻受体材料,在抗性再生材料中筛选鉴定定向敲除突变体材料。实验结果表明,除OsCKX1-sgRNA1位点外,针对不同OsCKX基因家族成员构建的CRISPR-Cas9编辑载体显示明确的编辑活性,不同位点编辑效率从27.3%（OsCKX1-sgRNA2）到100%（OsCKX3-sgRNA1）不等。考虑到潜在的无活性sgRNA位点,实验采取了双sgRNA设计策略,有效确保了OsCKX基因家族成员定向敲除突变体的创制效率;2.基于CRISPR-Cas12a核酸酶编辑系统向导RNA（crRNA）设计标准,针对OsCKX1OsCKX11基因编码区扫描5’-TTTV-3’四核苷酸PAM位点,选取PAM下游23 bp DNA序列作为crRNA识别区域,构建OsCKX1OsCKX11定向敲除编辑载体,并进行遗传转化、再生及突变体筛选鉴定。实验结果表明,CRISPR-Cas12a核酸酶编辑系统稳定性一定程度上优于CRISPR-Cas9核酸酶编辑系统,所有构建的CRISPR-Cas12a编辑载体均显示明确的编辑活性,编辑效率从23.1%（OsCKX5-crRNA）到100%（OsCKX8-crRNA）不等;3.针对筛选鉴定的OsCKX基因家族不同成员定向敲除突变体T0单株,收获其自交所得T1材料进一步进行基因分型鉴定,统计结果表明,T1分离材料基因型符合孟德尔遗传规律,所获得OsCKX突变可以稳定遗传。进一步对T1定向敲除突变体生长表型进行分析,发现OsCKX1、OsCKX6、OsCKX7敲除突变体材料籽粒变大,表现出一定的增产潜力。4.水稻OsCKX基因家族成员间相似度较高,为了有效避免基因冗余性干扰,进一步明确OsCKX基因家族不同成员生物功能,针对亲缘关系较近的OsCKX基因家族成员,基于CRISPR-Cas12a基因编辑体系构建多基因定向敲除载体,创制OsCKX多基因聚合突变体材料。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 研究背景
•     1.2.1 水稻分子育种概述
•     1.2.2 CRISPR-Cas基因编辑系统简述
•     1.2.3 植物细胞分裂素氧化/脱氢酶研究进展
•   1.3 立题依据
•   1.4 研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 工程菌株
•   2.2 实验试剂和实验仪器
•     2.2.1 实验试剂
•     2.2.2 实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 CRISPR-Cas核酸酶骨架载体
•     2.3.2 水稻CRISPR-Cas9 单基因定向敲除载体构建
•     2.3.3 水稻CRISPR-Cas12a单基因定向敲除载体构建
•     2.3.4 水稻CRISPR-Cas12a多基因定向敲除载体构建
•     2.3.5 质粒转化及提取
•     2.3.6 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
•     2.3.7 水稻突变体材料检测
•     2.3.8 T1 突变体材料分析
• 第三章 结果与分析
•   3.1 水稻OsCKXs基因家族定向敲除靶位点设计
•   3.2 基于CRISPR-Cas9的OsCKXs单基因定向敲除突变体创制
•     3.2.1 CRISPR-Cas9双sgRNA定向敲除载体设计及构建
•     3.2.2 OsCKXs双 sgRNA定向敲除突变体材料鉴定
•   3.3 基于CRISPR-Cas12a的 OsCKXs单基因定向敲除突变体创制
•     3.3.1 CRISPR-Cas12a定向敲除载体构建
•     3.3.2 OsCKXs单 crRNA定向敲除突变体材料鉴定
•   3.4 水稻OsCKXs定向敲除突变体遗传稳定性及表型分析
•     3.4.1 OsCKXs定向敲除突变体遗传稳定性分析
•     3.4.2 OsCKXs定向敲除突变体T1 表型分析
•   3.5 基于CRISPR-Cas12a的 OsCKXs多基因定向敲除突变体创制
•     3.5.1 OsCKXs基因家族成员分析
•     3.5.2 OsCKXs基因家族多基因定向敲除载体设计及构建
•     3.5.3 OsCKXs基因家族多基因定向敲除突变体材料创制
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间取得的研究成果
• 附录一
• 附录二

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王雁

导师: 张勇

关键词: 水稻,定向敲除突变体

来源: 电子科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 电子科技大学

分类号: S511;Q943.2

总页数: 68

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