论文摘要
土壤盐渍化是植物承受的最主要的环境胁迫之一,严重制约植物的生长,使得农作物的产量严重降低,危害国家的粮食安全。为了抵御土壤中盐离子的胁迫,植物体内产生了一系列的盐胁迫调控机制来适应环境。根部作为最直接感知盐胁迫信号的器官,在盐胁迫下的发育受到严重抑制。因此挖掘盐胁迫下调控根生长发育的关键因子并解析机制,对改良植物特别是作物在盐胁迫下的生长能力具有重要的理论和实践意义。本研究通过反向遗传学的方法对拟南芥盐胁迫诱导基因的T-DNA插入突变体库进行盐处理下的表型筛选,筛选到了一个在盐胁迫下主根生长被严重抑制的突变体。该突变体中编码丙酮酸脱氢酶E1α亚基的基因IAR4发生了突变。IAR4突变后增加了植株对盐离子的敏感性,导致了盐胁迫下iar4突变体主根生长极度迟缓,并且存活率明显下降。进一步研究发现在盐胁迫条件下,iar4突变体体内SOS信号途径中的SOS1和SOS3基因的激活被严重抑制,从而导致iar4突变体在盐胁迫下积累了更多的Na+以及更高的Na+/K+比值,破坏了体内的盐离子平衡,造成了Na+毒害作用,对植株的生长产生了严重影响。通过对IAR4调控盐胁迫下植物根生长的生理机制研究发现,在盐胁迫下,iar4突变体中的ROS清除系统不能被正常激活,破坏了体内ROS产生与清除的平衡,导致了ROS在体内过量的积累,从而影响植株在盐胁迫下的根长发育。IAR4基因的突变会降低根尖分生组织的活性,使得根部区域细胞数目变少以及细胞长度变短。盐胁迫处理会加剧iar4突变体对盐敏感的表型,使根部分生区的活性以及细胞分裂的能力都受到严重的抑制,从而导致了根长发育极度迟缓。当外源施加ROS还原剂GSH时,iar4突变体根部分生区的活性以及细胞分裂的能力都得到部分的恢复。表明盐胁迫抑制主根生长可能是由于盐胁迫下大量积累的活性氧抑制了根尖分生组织的活性导致。植株根部的发育以及根尖分生组织活性的维持都是通过生长素的运输以及分布来调节的。进一步对IAR4通过调控ROS来影响根长发育进行生理、分子以及细胞学上的研究时发现,盐胁迫抑制了突变体根部生长素极性运输相关的ProPIN1:PIN1-GFP、ProPIN2:PIN2-GFP、ProPIN3:PIN3-GFP以及生长素应答相关ProDR5:GFP的表达水平,导致根尖生长素分布少,抑制根尖分生组织活性以及细胞分裂水平,使得根生长受到严重抑制。当外源施加ROS清除剂GSH或者添加生长素时,iar4突变体中生长素极性运输的转运子的表达得到恢复,并部分恢复了分生组织活性和主根根长。这些结果表明iar4突变体中过多积累的ROS抑制主根的发育是通过抑制生长素的运输和分布来实现的。本论文研究通过反向遗传学方法找到了拟南芥中调控盐胁迫应答的一个新基因IAR4,该基因整合了ROS和生长素途径,通过调节PIN介导的生长素极性运输从而调控盐胁迫下主根的生长。我们的研究主要解析了IAR4调控盐胁迫下根部生长的机制,同时阐明了ROS和生长素在盐胁迫下的互作关系。
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摘要ABSTRACT缩略语表1 文献综述 1.1 植物盐胁迫研究进展 1.1.1 盐胁迫对植物的影响 1.1.2 盐胁迫对植物根系的影响 1.1.3 植物耐盐机理的研究 1.1.3.1 植物对渗透压胁迫的调控 1.1.3.2 植物对离子毒害的调控 1.2 生长素对植物的影响 1.2.1 生长素的合成 1.2.1.1 依赖色氨酸的生长素合成途径 1.2.1.2 不依赖色氨酸的生长素合成途径 1.2.2 生长素的信号转导 1.2.3 生长素的极性运输 1.2.3.1 生长素输入载体 1.2.3.2 生长素输出载体 1.3 氧化胁迫对植物的影响 1.3.1 活性氧对植物发育的影响 1.3.2 活性氧的产生 1.3.3 活性氧的清除 1.3.3.1 酶促清除系统 1.3.3.2 非酶促清除系统 1.4 生长素和活性氧之间的交叉作用 1.4.1 ROS影响生长素的合成与代谢 1.4.2 ROS影响生长素的运输与信号转导 1.4.3 ROS和生长素的cross-talk对植物的影响 1.5 丙酮酸脱氢酶家族研究进展 1.5.1 丙酮酸脱氢酶复合物的结构与种类 1.5.2 丙酮酸脱氢酶复合物的研究概况 1.5.3 植物中丙酮酸脱氢酶的研究概况 1.6 本研究的目的与意义2 材料与方法 2.1 拟南芥材料 2.2 实验所用到的菌株和质粒载体 2.3 拟南芥的种植方法 2.3.1 拟南芥种子的清洗 2.3.2 拟南芥的种植 2.4 常用培养基的配方 2.5 拟南芥水培生长方法 2.5.1 水培液的配置 2.5.2 水培装置的改造以及水培生长 2.6 拟南芥基因组总DNA的提取与基因型鉴定 2.6.1 植物DNA快速抽提法 2.6.2 CTAB法抽提植物基因组DNA 2.6.3 基因型鉴定 2.7 拟南芥RNA的提取 2.8 拟南芥的基因表达量检测 2.8.1 半定量PCR检测表达量 2.8.2 qRT-PCR检测表达量 2.9 遗传转化载体的构建和转化 2.9.1 回补载体的构建 2.9.2 GUS染色载体构建 2.9.3 遗传转化 2.9.4 转基因植株的筛选 2.10 拟南芥植株抗逆性实验 2.10.1 盐胁迫处理下植株表型统计 2.10.2 甘露醇处理下植株表型统计 2.10.3 GSH或 NAA处理下的植株表型统计 2.11 拟南芥根系结构的观察 2.11.1 拟南芥幼苗根部胁迫处理 2.11.2 根尖拍照 2.11.3 根尖各区域细胞统计+及K+含量检测'> 2.12 Na+及K+含量检测 2.13 活性氧检测2DCF-DA荧光探针标记检测'> 2.13.1 H2DCF-DA荧光探针标记检测 2.13.2 DAB染色 2.13.3 NBT染色 2.14 ROS清除酶CAT、SOD酶活检测 2.14.1 CAT酶活检测 2.14.2 SOD酶活检测 2.15 MDA含量的检测 2.16 激光共聚焦检测GFP荧光蛋白3 结果与分析 3.1 盐敏感突变体的筛选与表型鉴定 3.1.1 盐敏感突变体的筛选 3.1.2 拟南芥突变体基因型鉴定与表达量检测 3.1.3 IAR4 缺失突变体的表型确定与分析 3.2 IAR4 的表达模式分析 3.3 IAR4 缺失突变体的耐盐性分析 3.4 IAR4 回补突变体的耐盐性检测 3.4.1 IAR4 回补突变体的获得以及表达量检测 3.4.2 IAR4 回补突变体在盐处理条件下的根长分析 3.5 IAR4 缺失突变体盐胁迫相关检测 3.5.1 IAR4 缺失突变体对渗透压胁迫的分析+/K+含量'> 3.5.2 IAR4 缺失突变体Na+/K+含量 3.5.3 IAR4 缺失突变体盐胁迫相关基因表达量检测 3.6 IAR4 缺失突变体活性氧变化检测 3.6.1 IAR4 缺失突变体盐处理下活性氧积累过多 3.6.2 IAR4 缺失突变体活性氧相关基因表达量检测 3.6.3 IAR4 缺失突变体活性氧清除酶含量检测 3.7 IAR4 缺失突变体根部分生区活性的变化 3.7.1 IAR4 缺失突变体根尖细胞数目和长度的检测 3.7.2 IAR4 缺失突变体细胞周期基因检测 3.8 GSH处理会恢复盐胁迫下突变体的根部变化 3.8.1 GSH对 IAR4 缺失突变体根长的影响 3.8.2 GSH对 IAR4 缺失突变体细胞分裂的影响 3.9 盐胁迫抑制根部生长素响应和运输水平 3.9.1 盐胁迫抑制根部生长素响应水平 3.9.2 盐胁迫抑制根部生长素的运输水平 3.10 生长素恢复盐处理下IAR4 缺失突变体根部表型 3.10.1 生长素部分恢复盐胁迫下根长变化 3.10.2 生长素部分恢复盐胁迫下生长素响应的变化 3.10.3 生长素部分恢复盐胁迫下PINs的变化 3.11 GSH可部分恢复盐胁迫下的生长素响应和运输水平 3.11.1 GSH可部分恢复盐胁迫下的生长素响应水平 3.11.2 GSH可部分恢复盐胁迫下的PINs表达4 讨论 4.1 IAR4 调控盐胁迫下主根生长 4.2 IAR4 影响生长素的动态平衡 4.3 IAR4 参与盐胁迫下ROS对生长素的极性运输 4.4 研究展望参考文献附录 附录Ⅰ 本实验所用引物信息 附录Ⅱ 部分实验操作步骤 附录Ⅲ致谢
文章来源
类型: 博士论文
作者: 付阳
导师: 胡红红
关键词: 拟南芥,盐胁迫,主根长,活性氧,生长素运输,分生区活性
来源: 华中农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 华中农业大学
分类号: Q945.78
DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000145
总页数: 143
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标签：拟南芥论文; 盐胁迫论文; 主根长论文; 活性氧论文; 生长素运输论文; 分生区活性论文;
