呼伦贝尔牛羊淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）流行病学研究

论文摘要

淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）是布尼亚病毒目（Bunyavirales）、沙粒病毒科（Arenaviridae）、哺乳动物沙粒病毒属（Mammarenavirus,MARV）的负链RNA病毒。LCMV呈世界性分布,啮齿类动物是其自然宿主,可通过直接接触或经气溶胶传播造成LCMV感染。LCMV感染人可导致流感样症状或无菌性脑炎,免疫缺陷患者感染后致死率较高。孕妇在怀孕期间感染LCMV可导致流产、死胎、畸形、新生儿小头症及其他中枢神经系统后遗症。LCMV引发的人兽共患病常被忽视,严重威胁人类生命健康,已成为一个亟待解决的公共卫生问题。2018年我国首次在东北地区蜱中发现并分离到LCMV,蜱作为LCMV携带者感染率高达2.5%-12.2%。蜱是第二大病原体传播媒介,通过叮咬吸血传播多种人畜共患疾病。LCMV有可能在蜱中垂直传播或水平传播给其他脊椎动物和人,但现在未有相关研究。内蒙古自治区呼伦贝尔地区是蜱传疾病流行区域,对该地区牛、羊进行LCMV流行病学调查,有助于了解当地哺乳动物LCMV感染情况与LCMV在不同宿主之间循环传播方式,为LCMV有效防控提供科学依据。本研究在前期研究基础上,原核表达LCMV核衣壳（NP）蛋白,建立间接ELISA及荧光定量检测方法,进行了LCMV血清学及分子流行病学研究。LCMV NP蛋白原核表达。根据已发表的4株蜱源LCMV NP序列（MG554174,MG554175,MG554176,MG554177）设计特异性引物,通过RT-PCR从病毒基因组中获得目的基因后,构建原核表达载体pET-30a-LCMV-NP,转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,通过亲和层析纯化获得重组蛋白。结果表明,通过RT-PCR技术扩增得到1785 bp目的基因,与蜱源LCMV同源性100%;表达的重组蛋白大小为56.4 kDa,纯化后蛋白浓度为0.626 mg/mL,具有反应原性。牛羊LCMV血清流行病学研究。2017年5月在呼伦贝尔地区采集牛血清样本234份、羊血清样本221份。以重组蛋白LCMV-NP（0.2μg/mL）作为包被抗原,采用间接ELISA法检测牛、羊血清中LCMV特异性抗体。结果显示,牛、羊血清中特异性抗体阳性率分别为2.56%（6/234）和4.52%（10/221）。牛羊LCMV分子流行病学研究。为建立更加灵敏的LCMV核酸检测方法,根据GenBank上LCMV NP基因保守区设计qPCR引物,进行染料法引物筛选和反应条件优化。结果表明,建立的实时荧光定量RT-qPCR法的R2值为0.997,扩增效率为96.498%,敏感性与特异性良好。通过本实验建立的实时荧光定量RT-qPCR方法检测上述牛、羊血清中LCMV RNA阳性率分别为21%（49/234）和19.9%（44/221）。血清学检测结果表明牛羊存在LCMV既往感染,分子生物学检测结果表明牛羊大多在近期感染LCMV,提示了LCMV可能在牛羊中存在持续性感染。PCR扩增得到牛LCMV NP基因序列与蜱源LCMV同源性最高为98%。系统进化树分析发现,牛源LCMV属于严重疾病相关的Ⅰ型LCMV,且与蜱源LCMV处于同一进化分支,提示牛体内的LCMV可能来源于蜱。本研究成功表达了LCMV NP重组蛋白,建立了LCMV检测间接ELISA和荧光定量PCR方法,对内蒙古呼伦贝尔地区牛羊LCMV流行情况进行了调查,提供了牛羊LCMV感染证据,为LCMV在不同宿主间的传播与遗传进化研究提供理论依据,也为LCMV的有效诊断防控奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
•   第一章 东北地区常见蜱传疾病
•     1.1 蜱传立克次体病
•     1.2 蜱传埃立克体病
•     1.3 莱姆病
•     1.4 蜱传脑炎
•     1.5 发热伴血小板减少综合征
•     1.6 蜱源淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
•     1.7 蜱传无形体病
•     1.8 蜱传巴贝西虫病
•   第二章 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒研究进展
•     2.1 LCMV概述
•     2.2 LCMV病毒特征
•     2.3 LCMV致病机理
•     2.4 LCMV流行病学研究
•     2.5 LCMV检测诊断
•     2.6 LCMV预防治疗
• 第二篇 研究内容
•   第一章 内蒙古呼伦贝尔地区牛羊LCMV血清流行病学调查
•     1.1 材料和方法
•     1.2 结果
•     1.3 讨论
•     1.4 小结
•   第二章 内蒙古呼伦贝尔地区牛羊LCMV分子流行病学调查
•     2.1 材料和方法
•     2.2 结果
•     2.3 讨论
•     2.4 小结
•   第三章 结论
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张力

导师: 魏峰

关键词: 原核表达,流行病学调查,荧光定量

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000290

总页数: 60

文件大小: 1544K

下载量: 41