全文摘要
本发明公开了一种S.trachelii的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用。该LAMP检测引物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；检测试剂盒包括LAMP检测引物、LAMP反应液。本发明根据S.trachelii的核糖体内转录间隔区设计引物，采用LAMP技术进行检测，特异性强、灵敏度高，具有快速、准确性高、现场应用方便等优点，解决了现有S.trachelii检测技术中存在的周期长、灵敏度低、成本高、现场应用困难等缺陷，对S.trachelii检疫鉴定、监测和减少对农药盲目使用方面具有重要意义。
主设计要求
1.一种S.trachelii的LAMP检测引物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA-3′；BIP：5′-TTGGTATTCCATGGGGCATGCCGCGAGACAAACACCCAACA-3′；F3：5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′；B3：5′-TCGTTTTGAGGCGAGTCTG-3′；LF：5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′；LB：5′-TGTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′。
设计方案
1.一种S.trachelii的LAMP检测引物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：
FIP：5′-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA-3′；
BIP：5′-TTGGTATTCCATGGGGCATGCCGCGAGACAAACACCCAACA-3′；
F3：5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′；
B3：5′-TCGTTTTGAGGCGAGTCTG-3′；
LF：5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′；
LB：5′-TGTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′。
2.权利要求1所述的LAMP检测引物在检测S.trachelii中的应用。
3.一种S.trachelii的LAMP检测试剂盒，其特征在于：至少包括引物溶液和LAMP反应液；其中，引物溶液中的引物为正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成，各引物序列具体如下：
FIP：5′-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA-3′；
BIP：5′-TTGGTATTCCATGGGGCATGCCGCGAGACAAACACCCAACA-3′；
F3：5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′；
B3：5′-TCGTTTTGAGGCGAGTCTG-3′；
LF：5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′；
LB：5′-TGTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′。
4.根据权利要求3所述的S.trachelii的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的LAMP反应液含有10×ThermoPol Buffer、MgSO 4<\/sub>、甜菜碱、dNTPs、Bst聚合酶和显色剂HNB。
5.权利要求3所述的S.trachelii的LAMP检测试剂盒在检测S.trachelii中的应用。
6.一种检测S.trachelii的方法，其特征在于：提取待检菌株的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP检测引物或权利要求3所述的LAMP检测试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在S.trachelii；紫色表示检测结果为阴性，不存在S.trachelii。
设计说明书
技术领域
本发明属于农作物病原菌检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种Stagonosporopsis trachelii(S.trachelii)的环介导等温扩增(LAMP)检测引物、检测试剂盒及其应用，可用于S.trachelii的快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于S.trachelii的早期诊断和病原菌的检测和鉴定。
背景技术
Stagonosporopsis属的菌种大多为植物病原菌，影响许多重要农作物和观赏植物的正常生长。如S.tanaceti严重影响除虫菊的生长，是澳大利亚除虫菊酯生产的主要生物限制因素之一；三种近缘真菌S.cucurbitacearum，S.caricae和S.citrulli是引起全球黄瓜茎枯病的主要病原菌，侵染至少13属24种的葫芦科植物，包括西瓜、黄瓜、南瓜和葫芦等重要作物。而S.trachelii曾报道在意大利引起彩钟花的叶斑病，2017年本课题组首次在玄参上分离出这种病原菌，田间病株率达87％，影响玄参Scrophularia ningpoensis正常生长，引起玄参叶斑病，严重影响植株的光合作用，导致玄参根部严重萎缩，品质已不能满足中草药加工的标准，影响药用价值，在我们所调查的江苏、贵州、广东三省不同产区均有发生，一旦发现该种病害，经济损失惨重。玄参是我国传统常用中药材之一，国内外市场对于玄参的需求量均呈现与日俱增的趋势，检验检疫性部门应对这种新病原菌的存在引起注意。为了阻止Stagonosporopsis trachelii传播范围的不断扩大，防止该病的大面积爆发，使其引起的病得到控制，开发快速灵敏的检疫鉴定Stagonosporopsis tracheli的技术迫在眉睫。
目前针对Stagonosporopsis trachelii的检测鉴定方法国内外还未有相关报道。一般而言，Stagonosporopsis trachelii的分类鉴定和检测方法主要有传统方法和分子生物学方法两大类，传统方法主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等性状。传统方法在Stagonosporopsis trachelii的检测鉴定中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制；特别是诊断一些致病症状及形态特征极其相似而难以区分的病原菌，给传统的鉴定方法更带来了巨大的挑战。随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为基础的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，如常规PCR、巢式PCR、实时荧光PCR等，这类方法具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，现已被广泛使用于鉴定和定量分析各类病毒、细菌、真菌和卵菌病原微生物。然而，该方法检测时间仍然比较长，之后的电泳跑胶费时费力，且需要依赖精密且价值较高的PCR仪，不能满足快速检测的需求。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种高效的核酸扩增方法。它是一种新型的分子生物学检测技术，该方法是根据靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用Bst DNA聚合酶的链置换反应，在60-65℃恒温条件下短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，可将目的基因扩增到10 9<\/sup>倍，由此来断定扩增产物是否存在目标基因，并可用琼脂糖凝胶电泳及SYBR Green I荧光定量的方法对其产物、扩增灵敏度进行分析。为了使LAMP终产物检测更加简单、直观、省时，国内外科学家进行了大量的研究，先后提出浊度分析法、HNB指示剂、蜡丸染料等简便易操作的LAMP终产物检测及结果判断方法，目前应用较多的是琼脂糖凝胶电泳、浊度分析法、HNB指示剂法与SYBR Green I指示剂法。该技术不需要严格的实验环境和精密昂贵的仪器设备，操作步骤简单易学，具有高特异性、高灵敏性等特点。该技术从2003年开始首先被用于医学的临床检测，取得了引人注目的效果。许多学者已经将其广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测，目前尚未见环介导等温扩增方法检测S.trachelii的方法及试剂盒的相关开发。
发明内容
发明目的：针对现有技术中对S.trachelii检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，本申请的目的是提供一种S.trachelii的LAMP检测引物以期实现特异性检测鉴定出S.trachelii。本申请的另一目的是提供上述S.trachelii的检测试剂盒，使得S.trachelii的检测灵敏、方便和快捷。本申请的另一目的是提供上述S.trachelii的检测方法，以解决现有方法耗时长、程序繁琐、准确度低等问题。
技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案为：
一种S.trachelii的LAMP检测引物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成，各引物序列具体如下：
FIP：5′-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA-3′；
BIP：5′-TTGGTATTCCATGGGGCATGCCGCGAGACAAACACCCAACA-3′；
F3：5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′；
B3：5′-TCGTTTTGAGGCGAGTCTG-3′；
LF：5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′；
LB：5′-TGTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′。
所述的LAMP检测引物在检测S.trachelii中的应用。
一种S.trachelii的LAMP检测试剂盒：至少包括引物溶液和LAMP反应液；其中，引物溶液中的引物为正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成，各引物序列具体如下：
FIP：5′-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA-3′；
BIP：5′-TTGGTATTCCATGGGGCATGCCGCGAGACAAACACCCAACA-3′；
F3：5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′；
B3：5′-TCGTTTTGAGGCGAGTCTG-3′：
LF：5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′；
LB：5′-TGTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′。
作为优选，所述的LAMP反应液含有10×ThermoPol Buffer、MgSO 4<\/sub>、甜菜碱、dNTPs、Bst聚合酶和显色剂HNB(羟基萘酚蓝)。
所述的S.trachelii的LAMP检测试剂盒在检测S.trachelii中的应用。
一种检测S.trachelii的方法：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP检测引物或所述的LAMP检测试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在S.trachelii；紫色表示检测结果为阴性，不存在S.trachelii。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点和积极效果为：
1)特异性强，所用的特异引物根据S.trachelii的核糖体内转录间隔区(ITS)不同区域设计出6条引物，特异性比常规PCR要强。
2)灵敏度高，对不同浓度的基因组DNA进行LAMP扩增，确定该LAMP体系最低检测限度为1pg\/μL，灵敏度是普通PCR的100倍左右。
3)检测时间短，1h左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2-4h。
4)仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅就可以完成检测。
5)操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器设备，稍具有分子生物学基础的人员即可完成。结果清晰明显，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。
6)对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。
综上所述，本发明是国内外首次对S.trachelii建立特定的分子检测手段，且发现本发明所采用的LAMP检测方法比常用PCR技术检测方法具有更强的特异性、灵敏度和便携性。该技术可从发病组织中直接检测出S.trachelii，对该菌引起的病害进行快速诊断，具有实际的应用价值。
附图说明
图1是LAMP方法和PCR方法对S.trachelii的特异性检测比较结果图；图中，A.HNB染色LAMP分析；B.PCR方法；1-12：不同地区采集分离的S.trachelii(依次是NJ1-1，NJ1-2，NJ1-3，NJ2-1，NJ2-2，NJ2-3，NJ3-1，NJ3-2，NJ3-3，NJ4-1，NJ4-2和NJ4-3)；13-20：其他真菌类群的八个菌株(花生2-1，辣椒炭疽，P6497，MLS-5，荔枝霜疫霉，214-4，G11，BE-1-1)；NC：空白对照(无DNA模板)；M：Marker III(天根，MD103，中国)；
图2是LAMP方法和PCR方法对S.trachelii的灵敏度检测比较结果图；图中，A.HNB染色LAMP分析；B.PCR方法；M：MarkerIII(天根，MD103，中国)；1-9：不同DNA模板浓度(依次为100ng\/μl、10ng\/μl、1ng\/μl、100pg\/μl、10pg\/μl、1pg\/μl、100fg\/μl、10fg\/μl、1fg\/μl)；NC：空白对照(无DNA模板)；
图3是自然感病玄参叶片中S.trachelii的LAMP和PCR检测法比较结果图；图中，A.HNB染色LAMP检测分析；B.PCR检测。1-10：依次从10张有典型斑点症状的玄参叶片中提取基因组DNA为模板；11：阳性对照(S.trachelii NJ1-2菌株基因组DNA为模板)；12-17：依次为6张健康玄参叶片中提取基因组DNA为模板；M：Marker III(天根，MD103，中国)；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：S.trachelii的LAMP检测引物的设计及引物特异性验证
1.供试菌株基因组DNA的提取
将供试菌株(表1)转至PDA培养基上培养，在25℃黑暗条件下培养7d，刮取菌丝后经冷冻抽干研磨成菌丝粉，用NaOH裂解法提取基因组DNA后作为DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
表1 在LAMP分析中所用到的全部菌株
a所有S.trachelii菌株和其他真菌菌株都由南京林业大学保存(公众可以通过市场途径获得)。NJFU，南京林业大学。*菌株数目。
2.S.trachelii的LAMP检测引物的设计
通过测定S.trachelii和其他Stagonosporopsis spp.的核糖体内转录间隔区(ITS)，对Stagonosporopsis属不同种间核糖体内转录间隔区(ITS)进行比对分析，利用专门的LAMP引物设计软件Ptimer Explore V4设计一套S.trachelii的特异性的LAMP检测引物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB组成，各引物序列如下：
FIP：5′-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA-3′；
BIP：5′-TTGGTATTCCATGGGGCATGCCGCGAGACAAACACCCAACA-3′；
F3：5′-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3′；
B3：5′-TCGTTTTGAGGCGAGTCTG-3′；
LF：5′-CACTGAATTCTGCAATTCACACTAC-3′；
LB：5′-TGTTCGAGCGTCATTTGTACC-3′。
3.S.trachelii的LAMP检测方法的建立及LAMP检测引物特异性验证
以表1供试菌株的DNA为模板，利用正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和正向环引物LF、反向环引物LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为26.5μL，包括2.5μl 10×ThermoPol Buffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，1.5μl MgSO 4<\/sub>(100mM)，4μl甜菜碱(5M)(Sigma，Shanghai，China)，3.5μl dNTPs(10mM)，FIP和BIP(10μM)各4μl，F3和B3(10μM)各0.5μl，LB和LF(10μM)各1μl，2μl HNB(Hydroxynaphthol Blue)(2.4mM)(阿拉丁，中国)，1μl Bst DNA聚合酶(8U·μL -1<\/sup>)(New En蚪and Biolabs)，1μl模板DNA。65℃反应1h，80℃加热5min停止反应；反应结果的测定：采用目测观察法，待LAMP反应结束后，直接肉眼观察，反应液为天蓝色判断为阳性，存在S.trachelii；反应液为紫色判断为阴性，不存在S.trachelii。
以表1供试菌株的DNA为模板，利用引物F3和B3进行常规PCR检测，作为对照，PCR体系为50μL，包括1μL模板DNA，0.25μL TaKaRa Taq，5μL 10×PCR Buffer，4μL dNTPMixture，F3和B3(10μM)各1μL，灭菌水补至50μL。PCR扩增条件为94℃5min，98℃10s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示电泳结果。
4.LAMP检测引物特异性验证结果
常规PCR与LAMP扩增的结果表明，供试菌株中只有S.trachelii显示结果可观察到天蓝色，其余真菌显示结果为紫色(图1)。从图1可知本申请所设计的内引物FIP\/BIP、外引物F3\/B3和环引物LF\/LB可以将S.trachelii和其他病原菌区分开来，具有种的特异性，用于S.trachelii快速可靠的检测和鉴定。
实施例2：S.trachelii的LAMP检测灵敏度测定
1.不同浓度基因组DNA的制备
应用Nanodrop 2000分光光度计测定S.trachelii基因组DNA浓度，将确定浓度的DNA依次进行10倍梯度稀释，使其浓度分别为100ng\/μl、10ng\/μl、1ng\/μl、100pg\/μl、10pg\/μl、1pg\/μl、100fg\/μl、10fg\/μl、1fg\/μl。
2.LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察
各取1μL DNA作为模板，利用正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为26.5μL，包括2.5μl 10×ThermoPol Buffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，1.5μl MgSO 4<\/sub>(100mM)，4μl甜菜碱(5M)(Sigma，Shanghai，China)，3.5μl dNTPs(10mM)，FIP和BIP(10μM)各4μl，F3和B3(10μM)各0.5μl，LB和LF(10μM)各1μl，2μl HNB(Hydroxynaphthol Blue)(2.4mM)(阿拉丁，中国)，1μl Bst DNA聚合酶(8U·μL -1<\/sup>)(New England Biolabs)，1μl模板DNA。65℃反应1h，80℃加热5min停止反应；反应结果的测定：采用显色剂目测观察法，待LAMP反应结束后，直接肉眼观察，反应液为天蓝色判断为阳性；反应液为紫色判断为阴性。
取1μL DNA作为模板，利用引物F3和B3进行常规PCR检测，作为对照，PCR体系为50μL，包括1μL模板DNA，0.25μL TaKaRa Taq，5μL 10×PCR Buffer，4μL dNTP Mixture，F3和B3(10μM)各1μL，灭菌水补至50μL。PCR扩增条件为94℃5min，98℃10s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示电泳结果。
3.LAMP扩增灵敏度检测结果
LAMP扩增灵敏度检测结果表明(图2)，100ng\/μl、10ng\/μl、1ng\/μl、100pg\/μl、10pg\/μl、1pg\/μl浓度的S.trachelii基因组DNA显色结果可观察到天蓝色；其余浓度及阴性对照显色结果为紫色。说明所设计的S.trachelii正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB通过LAMP扩增，对S.trachelii的灵敏度可达1pg\/μL，而常规PCR检测的灵敏度只能达到100pg\/μL，LAMP检测具有更高的灵敏度。
实施例3：发病组织中S.trachelii的LAMP检测
样品采集：采集S.trachelii侵染发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；
植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10μL 0.5mol\/L NaOH，在研钵中将组织充分研磨成糊后转入1.5mL离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5μL加入495μL 0.1mol\/L Tris-HCl(pH＝8.0)混合均匀，取1.0μL作为PCR模板进行扩增。
LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为26.5μL，包括2.5μl 10×ThermoPol Buffer(New England Biolabs，Ipswich，MA)，1.5μl MgSO 4<\/sub>(100mM)，4μl甜菜碱(5M)(Sigma，Shanghai，China)，3.5μl dNTPs(10mM)，FIP和BIP(10μM)各4μl，F3和B3(10μM)各0.5μl，LB和LF(10μM)各1μl，2μl HNB(Hydroxynaphthol Blue)(2.4mM)(阿拉丁，中国)，1μl Bst DNA聚合酶(8U·μL -1<\/sup>)(NewEngland Biolabs)，1μl模板DNA。65℃反应1h，80℃加热5min停止反应；反应结果的测定：采用目测观察法，待LAMP反应结束后，直接肉眼观察，反应液为天蓝色判断为阳性；反应液为紫色判断为阴性。
以上述提取的DNA为模板，利用引物F3和B3进行常规PCR检测，作为检测对照，PCR体系为50μL，包括1μL模板DNA，0.25μL TaKaRa Taq，5μL 10×PCR Buffer，4μL dNTPMixture，F3和B3(10μM)各1μL，灭菌水补至50μL。PCR扩增条件为94℃5min，98℃10s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示电泳结果。
检测结果：检测结果(图3)表明，S.trachelii发病的叶片及阳性对照通过LAMP扩增，显示结果为天蓝色，说明存在S.trachelii；而健康叶片显示结果为紫色，说明不存在S.trachelii，该套技术能用于植物组织中S.trachelii的快速分子检测。
LAMP检测与常规PCR检测对比(图3)，LAMP检测对DNA模板质量的要求低，方法更简便，从发病组织DNA提取到获得检测结果更为迅速，大大提高检测效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种S. trachelii的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用
<130> 100
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> FIP引物序列(Artificial)
<400> 1
ggcgcaatgt gcgttcaaag atgaacgcag cgaaatgcga ta 42
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> BIP引物序列(Artificial)
<400> 2
ttggtattcc atggggcatg ccgcgagaca aacacccaac a 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> F3引物序列(Artificial)
<400> 3
tctcttggtt ctggcatcga 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> B3引物序列(Artificial)
<400> 4
tcgttttgag gcgagtctg 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> LF引物序列(Artificial)
<400> 5
cactgaattc tgcaattcac actac 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> LB引物序列(Artificial)
<400> 6
tgttcgagcg tcatttgtac c 21
设计图
相关信息详情
申请码:申请号:CN201910541160.X
申请日:2019-06-20
公开号:CN110172527A
公开日:2019-08-27
国家:CN
国家/省市:84(南京)
授权编号:授权时间:主分类号:C12Q 1/6895
专利分类号:C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
范畴分类:18H;
申请人:南京林业大学
第一申请人:南京林业大学
申请人地址:210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路159号
发明人:郑新月;熊琴;王维;钱雨琳;李雪;张晨
第一发明人:郑新月
当前权利人:南京林业大学
代理人:邱兴天
代理机构:32274
代理机构编号:南京申云知识产权代理事务所（普通合伙）
优先权:关键词:当前状态:审核中
类型名称:外观设计
标签：lamp论文; 实时荧光定量pcr仪论文; 引物设计论文; 生物技术论文; lb论文; 特异性论文; 试剂论文; pcr技术论文; 巢式pcr论文; 定量pcr论文; 反向pcr论文;