导读:本文包含了酶克隆论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:噬菌体,解聚酶,肺炎克雷伯菌,解聚酶治疗
酶克隆论文文献综述
王灿[1]（2019）在《肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶克隆表达及抗菌活性研究》一文中研究指出目的肺炎克雷伯菌是引起医院获得性感染的常见革兰氏阴性条件致病菌之一。自上世纪80年代随着耐药性肺炎克雷伯菌出现,多重耐药肺炎克雷伯菌造成的复杂感染治疗愈加困难。随着全耐药性肺炎克雷伯菌的报道不断增多,迫使我们寻求治疗耐药性肺炎克雷伯菌感染的新型治疗策略与方法。本研究以荚膜型KN1型菌株Kp409为宿主菌,成功分离并鉴定一株裂解性噬菌体IME321,并对其进行全基因组高通量测序及相关生物信息学分析。在体外克隆表达噬菌体解聚酶、明确其抗菌活性后,在小鼠感染模型中评估该解聚酶的治疗及预防效果。方法以临床分离的肺炎克雷伯菌Kp409为宿主菌,从解放军总医院第五医学中心南院区(原解放军307医院)未经处理污水中筛选噬菌体;利用双层平板培养法测定噬菌体IME321的滴度,同时绘制噬菌体的最佳感染复数及一步生长曲线;经透射电镜观察负染法处理的噬菌体形态;提取噬菌体核酸,利用Ilumina Miseq高通量测序平台对噬菌体IME321进行全基因组测序,并进行有关生物信息学分析。PCR扩增噬菌体IME321解聚酶基因ORF42,将目的基因克隆进pEasy-BluntE1Expression Vector表达载体后诱导表达解聚酶(命名为Dp42),SDS-PAGE验证表达目的蛋白条带大小与预期是否相符。采用点滴法验证融合性表达的活性,采用联合血清实验验证其体外杀菌活性。腹腔注射法建立肺炎克雷伯菌Kp409感染小鼠模型。感染剂量分别为2×10~7cfu和2×10~8cfu,预防组在细菌感染前6h时分别腹腔注射50μg Dp42,治疗组在细菌感染后0.5h腹腔注射50μg Dp42,观察小鼠存活率,判断解聚酶Dp42对感染小鼠模型的保护效果。结果成功分离出一株噬菌体。根据国际病毒分类委员会(ICTV)规则,将其命名为vB_KpnP_IME321(简称IME321)。电镜观察该噬菌体具有正二十面体的头部,直径约38 nm,尾部特别短,仅约13 nm,属于有尾噬菌体(Caudovirales)目,短尾噬菌体科(podoviridae),Kp32病毒属。经双层平板法测定其最佳感染复数为0.01;进一步绘制一步生长曲线,其潜伏期较短,约为3min,爆发期25min,最终裂解量平均为410pfu/个。全基因组测序表明,IME321大小为39906bp,DNA呈线性双链基因组,G+C含量为52.8%,核苷酸含量为25.4%A、24.9%C、27.9%G和21.8%T。进一步对基因组注释分析:IME321基因中预测到49个ORF,这些基因的大小在123~3966 bp之间,这些ORF共覆盖39170 bp。没有整合酶、毒性或tRNA基因。基于噬菌体末端酶大亚基的系统发育树进一步分析并与GenBank公布的肺炎克雷伯菌噬菌体序列比对,IME321与美国、中国台湾研究团队分离的5株噬菌体同源最高,在进化树内聚集。蛋白BLASTp分析表明,IME321基因序列中ORF42编码一个T7超家族的假定尾丝蛋白。将IME321(位于33394-35857)ORF42基因克隆到pEasy-Blunt E1Expression Vector表达载体后,经SDS-PAGE鉴定,该蛋白分子量大小约为100kDa,经点板验证,该蛋白具有噬菌体解聚酶活性,命名为Dp42。体外实验发现Dp42单独使用可以在噬菌斑周围形成透明晕环、破坏细菌表面的荚膜多糖。与血清杀菌实验相比,Dp42联合血清杀菌能力明显提高、杀菌数量增加10倍(p<0.05),表现出协同杀菌作用。采用Balb/c小鼠肺炎克雷伯菌腹腔感染模型评价Dp42的体内杀菌活性。肺炎克雷伯菌在体外与解聚酶Dp42孵育0.5h后注射于小鼠腹腔,不论是低剂量(2×10~7cfu)感染还是高剂量(10~8cfu)感染,小鼠的死亡率均明显降低(16.7%vs 100%,p<0.05;25%vs 100%,p<0.05;每组均为8只小鼠)。直接将未经解聚酶Dp42体外处理的肺炎克雷伯菌注射于小鼠腹腔复制感染模型,不论是低剂量感染(2×10~6cfu)还是高剂量感染(2×10~7cfu),亦或是预防性给药(2×10~7cfu和2×10~8cfu)(感染前6h)还是治疗性给药(感染后0.5h),解聚酶Dp42均具有明显的保护效果,实验动物的存活率均为100%(n=8,p<0.05)。结论1.本研究采用临床分离的肺炎克雷伯菌,通过医院污水成功分离出1株裂解性噬菌体(IME321),并完成了该噬菌体的生物学鉴定与基因组学分析。2.成功克隆表达了IME321的解聚酶(Dp42),体外验证了该酶的抑菌作用及其与血清的协同杀菌活性。3.在Balb/c小鼠肺炎克雷伯菌腹腔感染模型上系统评价了解聚酶(Dp42)对感染动物的保护效果。研究结果表明解聚酶(Dp42)具有明确的杀菌作用,对小鼠腹腔感染模型有明显的保护效果,值得进一步研究,为耐药细菌感染的防治提供新思路与新方法。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2019-03-01）
张宝,王志航,储卫华[2]（2019）在《群体感应淬灭酶克隆表达及其对铜绿假单胞菌的影响》一文中研究指出【背景】由于抗生素的大量使用,导致细菌耐药性越来越强,寻找新的抗细菌感染药物成为研究热点。【目的】克隆表达群体感应淬灭酶,探究其对铜绿假单胞菌毒力及致病性的影响。【方法】利用PCR技术从产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌QSI-1基因组DNA中克隆出aiiA基因,将其克隆到表达载体pET30a并导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶。用不同浓度的淬灭酶作用于铜绿假单胞菌,检测其对铜绿假单胞菌毒力因子产生以及生物膜形成能力的影响;以秀丽隐杆线虫为模型,考察其对线虫感染铜绿假单胞菌存活率的影响。【结果】克隆表达出群体感应淬灭酶,该酶能显着抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生和生物膜的形成,并能降低铜绿假单胞菌对感染线虫的致死率。【结论】群体感应淬灭酶可作为一种能高效抑制细菌致病性的物质,为临床治疗细菌性感染提供新的策略。(本文来源于《微生物学通报》期刊2019年11期）
李书凝[3]（2018）在《浅析谷氨酸脱羧酶克隆分析与应用》一文中研究指出谷氨酸脱羧酶(GAD)能够催化L-谷氨酸(L-Glu)生成γ-氨基丁酸(GABA),GAD是生物技术富集生产GABA的关键酶,GABA作为一种抑制性神经递质,在哺乳动物体内有着多种重要的生理功能。因而研究GAD有着广泛的应用前景。但由于GABA天然含量较低,利用谷氨酸脱羧酶GAD催化谷氨酸生物合成是目前的研宄热点。因此,如何获得高纯度高效率的谷氨酸脱羧酶是一个具有巨大潜力和重要意义的研究项目。而且谷氨酸脱羧酶酶在食品、医学、工业、酒业等方面都具备广大、宽阔的前景,值得我们深入研究分析。本论文研究目的是通过菌体培养,基因组提取,引物设计,pcr扩增,测序结果分析等方法来获得高纯度高效率的谷氨酸脱羧酶。(本文来源于《饮食科学》期刊2018年10期）
曹得萍,张耀刚,李超群,刘佳,姜博璠[4]（2018）在《细粒棘球绦虫转酮醇酶克隆表达及免疫性分析》一文中研究指出目的通过原核表达获得细粒棘球绦虫转酮醇酶(TK)表达产物,分析其作为棘球蚴病诊断抗原分子的价值。方法 PCR扩增TK基因,克隆至原核载体p MD19-Eg TK,随后亚克隆至表达载体p ET-28a,构建目的基因TK原核表达质粒p ET-28a(+)-Eg TK,转入大肠埃希菌BL21,分离纯化蛋白,经SDS-PAGE、Western blotting鉴定后,收集细粒棘球蚴病(CE组)、多房棘球蚴病(AE组)患者及健康人(健康组)血清,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白作为诊断抗原的价值。结果成功构建p ET-28a(+)-Eg TK质粒,经SDS-PAGE和Western blotting分析,Eg TK蛋白在70 k Da处出现条带,与理论值一致。ELISA显示,CE组、AE组和健康组血清反应吸光度A450值间差异有统计学意义(F=44.47,P<0.01),CE组(1.46±0.41)、AE组A450值(1.28±0.29)高于健康组(0.66±0.23)(P<0.05),但CE组和AE组间A450值差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组TK分子可较好地区分棘球蚴病患者和非棘球蚴病患者,但无法区分细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者。(本文来源于《中国血吸虫病防治杂志》期刊2018年02期）
张叶影,崔海亮,杨静,葛新,王越[5]（2017）在《金黄色葡萄球菌血浆凝固酶克隆、表达、纯化及其生物活性研究》一文中研究指出【目的】克隆表达金黄色葡萄球菌血浆凝固酶,获取重组血浆凝固酶并分析其生物学活性,探讨其在口腔术后止血方面的应用前景。【方法】提取金黄色葡萄球菌基因组,以此为模板,利用PCR技术扩增出编码血浆凝固酶(coagulase,Coa)的基因,通过分子生物学方法构建表达带有his标签血浆凝固酶的p ET21a(+)-his-coagulase重组质粒。经PCR分析、酶切分析和测序鉴定后,转化至大肠杆菌BL21内。经IPTG诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平情况并经his柱纯化,获取血浆凝固酶重组蛋白,测定其对兔血浆及人血浆的凝固作用。【结果】PCR结果和酶切分析显示,得到了2 100 bp左右的核酸片段,与his-coagulase片段大小一致,测序结果也与预先设计序列一致;重组质粒经诱导表达后获得相对分子质量为78×103左右蛋白条带,纯化目的蛋白经测定具有促兔血浆及人血浆凝固活性。【结论】本研究成功构建了表达血浆凝固酶的重组质粒,获得了相应的工程菌株,以及具有促凝活性的重组血浆凝固酶,为口腔手术术后止血提供了新的方向。(本文来源于《武警后勤学院学报(医学版)》期刊2017年12期）
孙玉英,张继泉,王淑军,严翠[6]（2016）在《蜡状芽孢杆菌几丁质脱乙酰基酶克隆和表达》一文中研究指出从产几丁质脱乙酰基酶的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus M1)中获得了几丁质脱乙酰基酶BcCDA基因序列,并在大肠杆菌中实现了其高效分泌表达以及一步亲和法纯化重组几丁质脱乙酰基酶BcCDA,经SDS-PAGE检测该酶为单一条带,其分子量约为23 kD,所得重组BcCDA的具有脱乙酰基酶活性,其比活力为11 608.31U/mg。该研究为BcCDA作用机制的进一步研究和BcCDA的利用鉴定基础。(本文来源于《食品研究与开发》期刊2016年21期）
丁小维,田文婷,张波,杨枝,赵莹[7]（2016）在《盐湖微生物Fosmid文库纤维素酶克隆的筛选及产酶研究》一文中研究指出利用平板影印法,从陕西花马盐湖沉积物微生物免培养Fosmid文库4 126个克隆中,筛选到具有羧甲基纤维素酶活性的克隆17个。以纤维素酶活性较强的YH-13号克隆为出发菌株,研究其产酶条件。结果表明,以麦芽糖为最适碳源,以硫酸铵为最适氮源,最适p H值为4.5,最适发酵时间为2 d,最适产酶温度为37℃时该酶活性最高。这为进一步研究利用极端盐湖沉积物微生物纤维素酶基因奠定了基础。(本文来源于《陕西理工学院学报(自然科学版)》期刊2016年01期）
李景龙,袁永泽,李丹丹,杨雪婷,耿辉[8]（2015）在《假单胞菌HS-D36偏苯叁酚1,2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究》一文中研究指出由pnpC编码的偏苯叁酚1,2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase,PnpC)是微生物分解硝基芳香族类环境污染物的关键酶.本研究从对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)降解菌HSD38(Pseudomonas sp.)中克隆pnpC基因,利用E.coli BL21(DE3)高效表达重组PnpC,通过亲和色谱纯化并分析其催化特性.实验结果表明:HS-D36的pnpC开放阅读框长度为873bp,编码290个氨基酸,酶蛋白相对分子量33KD;20℃、异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导可高效表达重组PnpC;重组酶经Ni-NTA亲和色谱一步分离可达到电泳纯;纯酶比活力9.3U/mg,纯化倍数37.2,活力收率23.8%;重组PnpC催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃、最适pH 5.0;Lineweaver-Burk双倒数作图表明PnpC对邻苯二酚降解的米氏常数(Km)为21.95mol/L、最大反应速度(Vmax)为2.68mol/(min·mg);Fe3+、Cu2+、Fe2+和Zn2+对该酶具激活作用,Ni 2+则显示抑制效应.(本文来源于《华中师范大学学报(自然科学版)》期刊2015年05期）
万倩[9]（2015）在《粉尘螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定》一文中研究指出目的:在原核表达系统中进行表达纯化重组磷酸丙糖异构酶蛋白,并对该蛋白进行过敏原性鉴定。方法:①提取粉尘螨总RNA并逆转录成c DNA,RT-PCR扩增粉尘螨磷酸丙糖异构酶基因;②将上述PCR产物与p UC57连接后,热转化至E.coli Top10中,涂布于含氨苄霉素(100 mg/L)的LB平板上,37℃培养过夜后从LB平板上挑选白色菌落放入LB培养液中扩大培养,提取质粒。用Eco R I和Bam H I双酶切鉴定质粒,公司测序正确后进一步将酶切产物与p ET-32a表达载体连接转化至E.coli BL21;③利用生物学软件进行磷酸丙糖异构酶生物信息学分析,根据软件分析计算所得的数据构造进化树;④IPTG诱导重组菌株表达;产物经变性、复性、Ni-NTA螯合层析和Superdex75凝胶过滤层析纯化;用Western blotting实验检测重组磷酸丙糖异构酶的免疫原性;⑤收集4份来自广州医学院附属医院临床皮试的粉尘螨过敏患者阳性血清和2份健康体检者血清样本,用Western blotting、ELISA实验验证重组蛋白的过敏原性。进一步将重组磷酸丙糖异构酶蛋白进行人体皮肤点刺实验,检测44例人体皮肤点刺中磷酸丙糖异构酶蛋白的阳性率。结果:①结果成功构建重组的克隆载体和表达载体,PCR结果表明在预期位置出现与预期大小相一致特异性条带。②生物学软件分析磷酸丙糖异构酶是氨基酸数为247,分子质量为27134的疏水性蛋白。③SDS-PAGE结果显示,重组磷酸丙糖异构酶蛋白以包涵体的形式在原核生物体系中大量表达,复性纯化后的重组磷酸丙糖异构酶纯度较高,且重组蛋白能够与抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合。④Western blotting、ELISA结果显示,重组磷酸丙糖异构酶与4例粉尘螨过敏患者血清呈强阳性反应,2例健康对照组均为阴性。⑤人体皮肤点刺实验结果显示,粉尘螨提取物人体皮肤点刺44例受试者中16例磷酸丙糖异构酶蛋白呈阳性。结论:成功克隆并原核表达粉尘螨磷酸丙糖异构酶,重组的粉尘螨磷酸丙糖异构酶具有较强的过敏原性。(本文来源于《蚌埠医学院》期刊2015-05-01）
窦金焕,李钟淑,王雅春,董易春,周传丽[10]（2014）在《转抗仔猪腹泻基因α1-盐藻糖转移酶克隆猪的胰岛素样生长因子2表达分析》一文中研究指出为探求转基因克隆猪存在早期死亡率高及生长发育异常等原因,本研究首次以转抗仔猪腹泻基因α1-盐藻糖转移酶(fucosyl transferase 1,FUT1)阳性及阴性克隆猪的脾脏、肝脏及腿肌组织为试验材料,利用qRT-PCR技术定量检测影响胎儿及仔猪早期生长发育的印记基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)的表达情况,并以普通妊娠分娩猪为对照,分析其差异及变化。结果显示,IGF2基因在3类仔猪中均存在组织表达差异性,其中肝脏组织中表达量最高,腿肌组织中表达量最低。分析发现,IGF2基因在转FUT1阳性克隆猪脾脏组织中的表达量显着高于转FUT1阴性克隆猪(P<0.05),在腿肌组织中则显着低于阴性克隆猪(P<0.05)。此外,转FUT1阴性克隆猪的脾脏、肝脏组织IGF2表达量分别极显着低于、高于普通猪(P<0.01)。提示IGF2基因的表达变化可能与克隆猪早期生活力弱有关,但与转FUT1基因克隆猪早期死亡率高的关系还需进一步研究。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2014年12期）
酶克隆论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【背景】由于抗生素的大量使用,导致细菌耐药性越来越强,寻找新的抗细菌感染药物成为研究热点。【目的】克隆表达群体感应淬灭酶,探究其对铜绿假单胞菌毒力及致病性的影响。【方法】利用PCR技术从产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌QSI-1基因组DNA中克隆出aiiA基因,将其克隆到表达载体pET30a并导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶。用不同浓度的淬灭酶作用于铜绿假单胞菌,检测其对铜绿假单胞菌毒力因子产生以及生物膜形成能力的影响;以秀丽隐杆线虫为模型,考察其对线虫感染铜绿假单胞菌存活率的影响。【结果】克隆表达出群体感应淬灭酶,该酶能显着抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生和生物膜的形成,并能降低铜绿假单胞菌对感染线虫的致死率。【结论】群体感应淬灭酶可作为一种能高效抑制细菌致病性的物质,为临床治疗细菌性感染提供新的策略。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
酶克隆论文参考文献
[1].王灿.肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶克隆表达及抗菌活性研究[D].安徽医科大学.2019
[2].张宝,王志航,储卫华.群体感应淬灭酶克隆表达及其对铜绿假单胞菌的影响[J].微生物学通报.2019
[3].李书凝.浅析谷氨酸脱羧酶克隆分析与应用[J].饮食科学.2018
[4].曹得萍,张耀刚,李超群,刘佳,姜博璠.细粒棘球绦虫转酮醇酶克隆表达及免疫性分析[J].中国血吸虫病防治杂志.2018
[5].张叶影,崔海亮,杨静,葛新,王越.金黄色葡萄球菌血浆凝固酶克隆、表达、纯化及其生物活性研究[J].武警后勤学院学报(医学版).2017
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[7].丁小维,田文婷,张波,杨枝,赵莹.盐湖微生物Fosmid文库纤维素酶克隆的筛选及产酶研究[J].陕西理工学院学报(自然科学版).2016
[8].李景龙,袁永泽,李丹丹,杨雪婷,耿辉.假单胞菌HS-D36偏苯叁酚1,2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究[J].华中师范大学学报(自然科学版).2015
[9].万倩.粉尘螨磷酸丙糖异构酶克隆表达及过敏原性鉴定[D].蚌埠医学院.2015
[10].窦金焕,李钟淑,王雅春,董易春,周传丽.转抗仔猪腹泻基因α1-盐藻糖转移酶克隆猪的胰岛素样生长因子2表达分析[J].中国畜牧兽医.2014