陈爱萍1束盼21南京优科生物医药有限公司南京210029；2南京美新诺医药科技有限公司南京210029
【摘要】目的分析和鉴定注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠中的未知降解杂质。方法采用液相色谱-质谱（LC-MS/MS）法，采用加速降解的破坏条件，制备杂质含量较高的受试样品；以0.1%的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采C18色谱柱进行梯度洗脱；以电喷雾串联质谱电离源正离子模式进行质谱数据采集，对热降解破坏样品进行LC-MS/MS测定。结果获得注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的液相色谱图以液相色谱图对应的一级、二级质谱图，对谱图进行分析归纳，推测注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠中2个未知杂质为头孢哌酮杂质A进一步水解的产物，并推导了降解途径。结论本方法灵敏、可靠、快速，对头孢哌酮钠及其制剂的生产、质量监控具有指导意义。
【关键词】液质联用，注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠，未知杂质
IdentificationofunknownimpuritiesincefoperazoneandtazobactamforinjectionbyHPLC-MS
ChenAiping1，ZhuPan2（1.NanjinYokobio-Pharmaceuticalco.，ltd，Nanjing210029；2.XenoBioticLaboratories，Inc.，Nanjing，210029）
AbstractObjective：ToestablishaHPLC/MS/MSmethodfortheanalysisandidentificationofunknownimpuritiesincefoperazonesodiumandtazobactamsodiumforinjection.Method：PLC/MS/MSwasperformedonC18columnwithmobilephasewas0.1%formicacidsolutionandacetonitrile.Afterstressdegradationonhightemperature，thesamplewastestedanddatawascollectedinpositiveionmodeswithESIasionresource.Result：Thefirstandsecondmassspectrumofcefoperazoneanditsunknownimpuritiesweredetermined，itwasconcludedthattheimpuritieswerehydrolyzatesofcefoperazoneimpurityAaccordingthedegradationpathway.Conclusion：Themethodissensitive，rapidandcredibletechniqueinproductionandqualitycontrolofcefoperazoneanditspreparations.
KeywordsLC/MS/MS；cefoperazoneandtazobactamforinjection；unknownimpurity
【中图分类号】TQ320.66+2【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-03-200-07
注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠是由第三代头孢菌素类抗生素头孢哌酮钠和β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方制剂，临床上用于对头孢哌酮单药耐药、对本品敏感的产β-内酰胺酶细菌引起的中、重度感染[1]。本品在临床运用广泛，在2012年样本医院抗生素用药前10大品种排名第9。在抗生素药物种类中，头孢菌素类药物不良反应发生率明显高于其他药物[2]，可能和自身化学性质其不稳定，易产生降解杂质有关。建立灵敏、简便的杂质鉴定方法，控制杂质含量是新药开发的一个重要环节，也是保证安全用药的基础。近年来，我国对药物杂质控制紧跟美国、欧盟和ICH的要求，要求对超过0.1%的杂质进行鉴定[3]。由于头孢类杂质一般很不稳定，较难采用传统的分离制备及结构分析方式进行结构鉴定。高效液相/质谱（LC/MS/MS）技术集高效分离与定性分析功能于一体，具有快速、灵敏，样品预处理简单的优点，非常适用于含量低微、不易分离制备或不稳定杂质的定性分析[4]。
1材料
岛津UFLC-20A高效液相色谱仪、API-5000和4000LC/MS/MS质谱仪器（AB/MDSSICEX）、DAD检测器、LCSolution和Analyst1.5数据处理系统等。
注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠（南京优科制药有限公司，批号：20150301）。
甲酸为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈为色谱纯，购自Merck公司；水为娃哈哈纯净水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：BDSHYPERSIL，C18柱（4.6mm×250mm，5µm）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按表1进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；波长为230nm；柱温为30℃；进样量为20ul。用于液相色谱分析和分离。
表1：梯度洗脱程度
2.2质谱扫描条件
离子化方式ESI（+）；质量扫描范围m/z100—1000；离子化电压（IS）：4.5kV；温度：500ºC；雾化气（Gas1）：N2，40psi；涡轮气（Gas2）：N2，40psi；气帘气（CurtainGas）：N2，10psi；碰撞气（CollisionGas）：N2，6psi；入口电压（EP）：10V；去集束电压（DP）：100V；碰撞能量（CE）：15，20，25，30；扫描方式：Q1，MS2
2.3溶液的制备
称取本品适量，于高温（60℃）放置10天，用流动相制成浓度约为1mg/mL和10ug/mL的溶液，用于高效液相色谱和液质联用分析。另取本品适量，用流动相制成浓度约为10mg/ml的溶液，用于液相色谱分离。
2.4测定方法
由于注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠制剂样品中所含杂质成分较多，且含量较低，无法直接用液质联用进行分析，因此，对各待鉴定杂质进行高效液相色谱分离，反复进样，并使用自动流分收集仪将流份收集到96孔板中，以富集各杂质。之后，按各杂质的保留时间，将96孔板中的流份合并，氮气吹干后，用流动相复溶，并用高效液相色谱方法1进行分析，确认其保留时间与分离前一致。分离得到的各杂质用于液质联用分析，以鉴定其结构。
3结果
如图1所示，使用高效液相色谱方法进行分析，保留时间3.490分钟处为他唑巴坦杂质A、保留时间9.433分钟处为头孢哌酮杂质C、保留时间10.524分钟处为他唑巴坦、保留时间25.226分钟处为头孢哌酮杂质C、保留时间30.090分钟处为头孢哌酮、保留时间23.471、27.154分钟处为两个较大的未知杂质1和未知杂质2。
图1：注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠色谱图
Fig1：Chromatogramofcefoperazoneandtazobactamforinjection
3.1头孢杂质A的LC-MS/MS分析结果
如图2所示，分离后的头孢杂质A进行分析，头孢杂质A保留时间约为25.8分钟。头孢杂质A的一级质谱图中，观察到分子离子峰（[M+H]+m/z530）以及加合离子峰（[M+NH4]+m/z547，[M+Na]+m/z552），该杂质的液相保留时间及分子量与客户提供资料中报道的已知杂质头孢杂质A一致。头孢杂质A的二级质谱中产生的主要碎片离子m/z388，375，345，318，290，186，143等，与头孢哌酮一致，以上质谱信息与其结构一致。头孢杂质A的质谱裂解途径与图3所示。
图2头孢杂质A的LC/(+)ESI-MS和MS/MS数据
Fig2：DataofLC/(+)ESI-MSandMS/MSforcefoperazoneimpA
图3头孢杂质A的质谱裂解碎片信息
Fig3：MassfragmentationinformationofcefoperazoneimpA
3.2未知杂质1的LC-MS/MS分析结果
如图4所示，分离后的未知杂质1进行分析，保留时间约为24.5分钟。未知杂质1的一级质谱图中，观察到分子离子峰（[M+H]+m/z548）及加合离子峰（[M+Na]+m/z570，[M+K]+m/z586），比头孢杂质A的分子离子峰多18Da，推测可能为头孢杂质A的水解产物。未知杂质1的二级质谱中，主要的碎片离子为脱去二氮六元杂环所产生的，质荷比为m/z406，比头孢杂质A相应的碎片离子（m/z388）多18Da。质荷比m/z504的碎片离子，为母核脱去一份子CO2所产生的。其他碎片离子与头孢杂质A相似。因此推测未知杂质1的结构可能为头孢杂质A的水解产物。其质谱裂解途径与图5所示。
图4未知杂质1的LC/（+）ESI-MS和MS/MS数据
Fig4：DataofLC/（+）ESI-MSandMS/MSforcefoperazoneimp1
图5杂质1的质谱裂解碎片信息
Fig5：Massfragmentationinformationofcefoperazoneimp1
3.3未知杂质2的LC-MS/MS分析结果
如图6所示，分离后的未知杂质2，使用高效液相色谱方法2进行分析，保留时间较约为28.1分钟。未知杂质2的一级质谱图中，观察到分子离子峰（[M+H]+m/z532）及加合离子峰（[M+NH4]+m/z549，[M+Na]+m/z554），比头孢杂质A的分子离子峰多2Da，推测可能为头孢杂质A的加氢还原产物。杂质4-A的二级质谱中，主要的碎片离子为脱去二氮六元杂环所产生的，质荷比为m/z390，比头孢杂质A相应的碎片离子（m/z388）多2Da，其他碎片离子与头孢杂质A相似。因此推测未知杂质2的结构可能为头孢杂质A的加氢还原产物，其质谱裂解途径与图7所示。
图6未知杂质2的LC/（+）ESI-MS和MS/MS数据
Fig6：DataofLC/（+）ESI-MSandMS/MSforcefoperazoneimp2
4讨论
4.1流动相本品注册标准YBH06342005中，流动相为甲醇-0.0025mol/L四丁基氢氧化铵溶液（33：67，用磷酸调节pH值为4.0），在该洗脱条件下，头孢哌酮的理论板数只有1870，杂质的分离度较差，且四丁基氢氧化铵为非挥发性物质，不利于质谱检测。采用挥发性的甲酸，调整流动相体系，进行梯度洗脱，使得主峰和杂质均能被洗脱出来，理论板数和分离度都达到要求。
4.2头孢哌酮的pKa为2.65，采用正离子模式有较好的质谱响应。
4.3头孢类药物性质活泼，除在高温高湿条件下易降解外，在生产过程中也会引入副产物，而且其降解产物还会进一步降解产生新的杂质。该方法对头孢哌酮及其复方制剂中杂质的测定准确尽迅速，对跟踪测定中间体、控制产品质量也有积极的指导意义。
5、结论
LC/MS技术日趋成熟，广泛的应用于抗生素中杂质、降解产物等的分析[5，6]。本研究中采用高温降解样品进行杂质来源的分析，采用二级质谱数据，对头孢哌酮正离子模式下的质谱裂解途径进行了推测。本方法灵敏、可靠、快速，对注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的生产、质量监控具有指导意义。
参考文献：
[1]海口奇力制药股份有限公司，注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠说明书（1.125g），2013。
[2]金英锦常药抗生素的不良反应与合理用药分析.中国卫生产业.2015（18）：127-129
[3]ICH.IQ3A（R2），mpuritiesInNewDrugSubstances.2006年10月25日
[4]彭蕊，等.高效液相色谱/质谱联用技术快速鉴定左氧氟羧酸原料药中微量未知杂质.《兰州大学学报：自然科学版》，2013（2）：283-287
[5]欧贝丽，等。液相色谱-质谱联用技术头孢他啶中未知杂质的结构。海峡药学.2008，20（3）：48-50
[6]胡娟妮，等.液质联用法分析头孢呋辛酯原料药中的未知杂质.药物分析杂质.2014，34（7）：1177-1186