全基因组关联分析挖掘调控番茄叶片气孔形成的关键基因

论文摘要

番茄（Solanum lycopersicum）是重要的蔬菜作物,也是植物科学研究的模式植物。气孔是植物与外界进行气体和水分交换的通道,参与植物的光合作用、蒸腾作用、逆境响应。然而在番茄中对气孔发育的研究甚少。因此,研究植物气孔形成的分子机制具有重要的意义。本研究通过对500余份番茄重测序材料的全基因组关联分析（GWAS）,得到调控番茄叶片气孔数量（密度/单位面积）的基因SlGMDH和SlALMT15,并对基因进行序列分析和功能互补验证,进一步通过相关基因转录调控和逆境胁迫等实验来探究SlGMDH和SlALMT15对番茄气孔发育的调控。主要研究结果如下:1.对500余份番茄重测序种质材料叶片的气孔数量存在显著差异。显微观察发现番茄叶片气孔数量存在广泛变异,在100倍视野下,气孔数量从最少为11个到最多81个。2.通过GWAS分析鉴定出调控番茄叶片气孔数量（密度/单位面积）两个基因。结合重测序获得的4.1M SNPs对叶片气孔数量进行了全基因组关联分析,分别在第3号染色体和第11号染色体鉴定到调控番茄叶片气孔数量的关键基因SlGMDH和SlALMT15。GMDH是一个甘露糖脱水酶,ALMT15是铝激活苹果酸转运蛋白家族的成员。3.候选基因等位基因在启动子区域存在突变位点。对叶片气孔数量极端材料进行候选基因重测序及序列比对分析,结果显示,在SlGMDH和SlALMT15的ORF没有氨基酸变异,但它们在启动子区域存在碱基差异。SlGMDH启动子区域（3kb）有6处碱基突变,造成了18个顺式作用元件的差异;SlALMT15也是在启动子区域（3kb）有18处突变,造成了36个顺式作用元件的差异。4.两个候选基因在不同种质材料,即具不同气孔密度的材料的叶片中存在表达差异。对SlGMDH和SlALMT15在番茄叶片气孔数量极端材料中进行基因相对表达量测定,发现SlGMDH和SlALMT15在各材料中组成型表达,但SlGMDH在幼叶和茎中表达量较高,而SlALMT15只在茎中表达量较高。5.候选基因转基因功能验证表明它们分别具有调控叶片气孔密度功能。为了阐明SlGMDH和SlALMT15如何调控单位叶面积上气孔数量。通过CRISPR/Cas9敲除叶片气孔数量多的材料TS-9的SlGMDH基因导致气孔数量减少,同样,我们也观察到在TS-9敲除SlALMT15基因导致气孔数量减少;而在气孔数量少的材料TS-55中超表达SlGMDH或者SlALMT15并未出现气孔数量变多。6.两个调控气孔密度基因的可能调控机制。分别对SlGMDH-CR和SlALMT15-CR编辑的T2代转基因株系及其野生型材料中的气孔发育调控途径中相关基因进行表达量Q-PCR分析,发现在SlGMDH-CR转基因株系中气孔发育相关基因EPF1和FAMA上调表达,而POLAR下调表达。在SlALMT15-CR转基因株系中气孔发育相关基因EPF1,EPF2,ER,TMM,SCRM,SPCH,MUTE,FAMA等均上调表达。7.两个气孔密度调控基因还可能调控植株抗旱性。试验对苗龄40天的SlGMDH和SlALMT15基因敲除T2代转基因系进行干旱处理,进一步观察分析干旱处理后的表型及生理指标（光合速率、气孔导度、蒸腾速率和MDA）,发现在干旱胁迫下,敲除SlGMDH或SlALMT15基因,均可减少叶片气孔数量,减少水分散失,增强植物的抗旱性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
•   1.1 课题提出
•   1.2 GWAS研究进展
•     1.2.1 GWAS的原理
•     1.2.2 GWAS在植物中的应用
•   1.3 气孔研究进展
•     1.3.1 气孔发育过程
•     1.3.2 转录因子对气孔发育的调控
•     1.3.3 信号肽对气孔发育的调控
•     1.3.4 MAPK对气孔发育的调控
•     1.3.5 环境因素对气孔发育的调控
•     1.3.6 植物激素对气孔发育的调控
•   1.4 GMDH的研究进展
•   1.5 ALMT的研究进展
•   1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 主要菌株与载体
•     2.1.3 主要试剂
•   2.2 全基因组关联分析
•   2.3 目的基因的扩增及序列分析
•   2.4 组织表达分析
•   2.5 表达载体构建以及遗传转化
•     2.5.1 敲除载体CRISPR/Cas9 的构建
•     2.5.2 超量表达载体的构建
•   2.6 遗传转化和转基因植株的鉴定
•   2.7 相关基因的表达分析
•   2.8 干旱胁迫抗性实验
• 3 结果与分析
•   3.1 GWAS关联得到控制番茄气孔发育的位点以及相关基因
•   3.2 气孔发育候选基因的基因特性
•     3.2.1 候选基因SlGMDH的分析
•     3.2.2 候选基因SlALMT15 的分析
•   3.3 候选基因的表达模式分析
•   3.4 转基因功能互补验证
•     3.4.1 CRISPR/Cas9 敲除SlGMDH基因导致叶片气孔数量减少
•     3.4.2 CRISPR/Cas9 敲除SlALMT15 基因造成叶片气孔数量减少
•     3.4.3 超表达SlGMDH基因不影响叶片气孔生成
•     3.4.4 超表达SlALMT15 基因不影响气孔生成
•   3.5 CRISPR/Cas9 敲除候选基因可提高植株抗旱性
•     3.5.1 CRISPR/Cas9 敲除SlGMDH基因提高植株抗旱性
•     3.5.2 CRISPR/Cas9 敲除SlALMT15 基因提高植物抗旱性
•   3.6 SlGMDH和 SlALMT15 影响气孔发育过程中相关基因的表达
•     3.6.1 SlGMDH影响气孔发育过程中相关基因的表达
•     3.6.2 SlALMT15 影响气孔发育过程中相关基因的表达
• 4 讨论
•   4.1 SlGMDH调控番茄叶片气孔数量
•   4.2 SlALMT15 调控番茄叶片气孔数量
•   4.3 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 附表
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙鹏娅

导师: 叶志彪

关键词: 番茄,气孔密度,全基因组关联分析

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 华中农业大学

分类号: S641.2;Q943.2

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000800

总页数: 78

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