转录因子AaPIF3调控青蒿素生物合成的功能研究

论文摘要

青蒿是我国传统中药材,基源植物为菊科植物黄花蒿,本论文统称其为青蒿。其产生的次生代谢产物青蒿素是一种倍半萜内酯化合物,由于青蒿素含有独特的过氧桥结构,使得其对于治疗脑型疟疾和抗氯喹型疟具有速效和低毒的特点。目前青蒿素的市场供应主要还是依赖于从青蒿植株中提取,但是野生青蒿中青蒿素含量较低,且资源有限,无法满足巨大的市场需求。青蒿素产业的一个共同目标是开发高产青蒿素的青蒿新品种,随着现代分子生物技术的快速发展,寻找调控青蒿素生物合成的转录因子能够为培育高产青蒿素的优良青蒿提供新型候选基因,应用植物基因工程手段提高青蒿素含量和产量,从而降低生产成本,这逐渐成为近年来青蒿育种研究的热点。b HLH（basic helix-loop-helix）是植物体内广泛存在的一类转录因子,已在不同药用植物中被陆续发现和研究报道,它能参与调控植物中生物碱、类黄酮和萜类等次生代谢产物的生物合成。从青蒿中相继筛选到的两个b HLH类转录因子（Aa MYC1、Aab HLH1）,对青蒿素的生物合成具有正调控作用。光敏色素作用因子（Phytochrome interacting factors,PIFs）属于b HLH转录因子。拟南芥PIF3（At PIF3）不仅参与光信号传导过程,还能正调节花色素苷的生物合成,表明PIF3可参与调节植物次生代谢。本研究将青蒿（205个）和拟南芥（165个）的所有b HLH转录因子构建系统发育树,基于青蒿全基因组分析拟从青蒿中找到与拟南芥同源的PIF3序列,确定该基因并克隆,命名为Aa PIF3。针对这个转录因子本文采用分子生物学、生物化学和生物技术等研究方法,揭示了Aa PIF3在调控青蒿素生物合成中的功能,取得了以下研究结果:1.Aa PIF3通过直接激活Aa ERF1基因的转录间接调控青蒿素生物合成基因Aa PIF3在青蒿分泌型腺体中表达量最高,这与青蒿素生物合成关键酶基因的表达模式具有较高相似性。亚细胞定位研究显示,Aa PIF3定位于细胞核中。本文采用双荧光素酶分析和酵母单杂交技术研究了Aa PIF3与青蒿素生物合成基因以及转录因子Aa ERF1基因的相互作用关系。双荧光素酶分析实验结果表明,Aa PIF3能够增强青蒿素生物合成基因（ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1）与Aa ERF1基因启动子的活性,表明其对青蒿素的生物合成可能具有调控作用。随后酵母单杂交实验进一步显示,Aa PIF3与青蒿素生物合成基因（ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1）启动子之间没有直接互作;但却与Aa ERF1基因的启动子有直接互作。结合双荧光素酶和酵母单杂交实验结果,表明Aa PIF3能够通过直接转录激活Aa ERF1基因从而间接调控青蒿素生物合成基因的表达,进而提高青蒿素的生物合成能力。2.过表达Aa PIF3转基因青蒿中青蒿素含量增加以p HB质粒作为植物过表达载体,将构建的重组质粒p HB-Aa PIF3转入至根癌农杆菌EHA105中获得工程菌,用叶盘法转化野生型青蒿植株并用潮霉素筛选获得抗性植株。在过表达Aa PIF3的转基因青蒿植株中,Aa ERF1、ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1表达量呈极显著提高（p<0.01）,同时青蒿素和二氢青蒿酸含量也得到极显著提高（p<0.01）。在过表达Aa PIF3转基因青蒿中,OE-10、OE-21、OE-26株系的青蒿素含量分别达到15.91 mg/g DW（Dry Weight）、15.02 mg/g DW、15.41mg/g DW,相比野生型青蒿中的青蒿素含量（9.63 mg/g DW）分别提高了65.21%、55.97%、60.02%;二氢青蒿酸的含量比野生青蒿中其含量（0.76 mg/g DW）分别提高5.03倍、5.57倍和4.93倍,其含量分别达到了4.59 mg/g DW、4.99 mg/g DW和4.51 mg/g DW。3.干扰Aa PIF3转基因青蒿中青蒿素含量降低以p Bin19质粒作为植物干扰表达载体,将构建的重组质粒p Bin19-Aa PIF3转入根癌农杆菌EHA105中获得工程菌,用叶盘法转化野生型青蒿植株,通过卡那霉素筛选获得抗性植株。在干扰Aa PIF3转基因青蒿植株中,Aa ERF1、ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1表达量呈极显著降低（p<0.01）,同时青蒿素和二氢青蒿酸含量也呈极显著下降（p<0.01）。在干扰Aa PIF3的转基因青蒿中,RI-46、RI-53和RI-57株系的青蒿素含量分别为4.59 mg/g DW、4.99 mg/g DW和4.51 mg/g DW,相比野生型青蒿（9.63 mg/g DW）分别降低了52.33%、48.18%和53.16%;RI-46、RI-53、RI-57株系中二氢青蒿酸含量分别降至了0.15 mg/g DW、0.27 mg/g DW、0.14 mg/g DW,仅仅是野生型青蒿中二氢青蒿酸含量（0.76 mg/g DW）的19.74%、35.52%和18.42%。综上所述,本文从青蒿中克隆并鉴定了一个b HLH类转录因子（Aa PIF3）;Aa PIF3通过直接激活Aa ERF1的转录间接调控青蒿素生物合成基因,在过表达Aa PIF3转基因青蒿中青蒿素含量提高,干扰Aa PIF3转基因青蒿中青蒿素含量降低,这说明Aa PIF3在调控青蒿素生物合成中发挥了积极的促进作用,通过过表达Aa PIF3基因能培育出青蒿素含量提高的转基因青蒿。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 研究概况
•   1.2 青蒿素生物合成途径的研究进展
•   1.3 调控青蒿素生物合成的代谢工程研究进展
•     1.3.1 过表达青蒿素生物合成基因对青蒿素生物合成的影响
•     1.3.2 阻断竞争支路对青蒿素生物合成的影响
•     1.3.3 植物激素对青蒿素生物合成的影响
•     1.3.4 环境因素对青蒿素生物合成的影响
•     1.3.5 转录因子对青蒿素生物合成的影响
•   1.4 bHLH类转录因子对植物次生代谢的调控研究进展
• 第2章 绪论
•   2.1 研究目的和意义
•   2.2 研究内容
•   2.3 技术路线
• 第3章 试验与方法
•   3.1 试验材料及试剂耗材
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 菌株和质粒
•     3.1.3 试剂盒、酶及试剂的购买
•     3.1.4 实验所用仪器和设备
•     3.1.5 自配试剂
•     3.1.6 常用培养基
•   3.2 方法与步骤
•     3.2.1 植物RNA提取与测定
•     3.2.2 RNA反转录形成c DNA
•     3.2.3 qPCR反应体系
•     3.2.4 CTAB法提取DNA
•     3.2.5 琼脂糖凝胶电泳
•     3.2.6 PCR目的条带的回收
•     3.2.7 目的片段与克隆载体T连接
•     3.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）
•     3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化
•     3.2.10 农杆菌感受态的制备
•     3.2.11 农杆菌感受态细胞的转化
•     3.2.12 重组质粒的提取
•     3.2.13 重组子的鉴定和测序
•   3.3 AaPIF3基因的克隆与分析
•     3.3.1 3'RACE-Ready cDNA的构建
•     3.3.2 5'RACE-Ready cDNA的构建
•     3.3.3 AaPIF3全长cDNA扩增
•     3.3.4 氨基酸序列比对与进化树构建
•   3.4 AaPIF3基因的组织表达分析
•   3.5 AaPIF3的亚细胞定位
•     3.5.1 AaPIF3亚细胞载体构建
•     3.5.2 烟草瞬时转化
•   3.6 双荧光素酶分析
•     3.6.1 双荧光素酶分析载体构建
•     3.6.2 双荧光素酶报告基因活性检测
•   3.7 酵母单杂交实验
•     3.7.1 酵母培养基及各种试剂配制
•     3.7.2 酵母单杂交载体构建
•     3.7.3 酵母感受态细胞制备
•     3.7.4 酵母转化及显色反应
•   3.8 青蒿AaPIF3转基因植株的获得与分析
•     3.8.1 青蒿过表达AaPIF3载体构建
•     3.8.2 青蒿干扰AaPIF3载体构建
•     3.8.3 青蒿种子的萌发
•     3.8.4 青蒿的遗传转化
•     3.8.5 转基因青蒿PCR阳性鉴定
•     3.8.6 转基因青蒿中相关基因qPCR检测
•   3.9 转基因青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸含量检测
•     3.9.1 青蒿素的提取
•     3.9.2 HPLC测定青蒿素与二氢青蒿酸的含量
• 第4章 结果与分析
•   4.1 AaPIF3基因克隆与生物信息学分析
•     4.1.1 全基因组内分析青蒿中的bHLH家族
•     4.1.2 AaPIF3基因的克隆
•     4.1.3 AaPIF3蛋白序列比对分析
•     4.1.4 AaPIF3的分子进化树构建
•   4.2 AaPIF3基因表达模式分析
•   4.3 AaPIF3亚细胞定位
•   4.4 AaPIF3间接正调控青蒿素生物合成基因
•     4.4.1 AaPIF3能激活青蒿素生物合成基因的转录
•     4.4.2 AaPIF3对青蒿素生物合成基因的间接调控
•   4.5 AaERF1转录因子启动子分析
•   4.6 AaPIF3直接正调控AaERF1基因
•     4.6.1 AaPIF3能激活AaERF1基因的转录
•     4.6.2 AaPIF3与AaERF1基因启动子的相互作用
•   4.7 过表达及干扰AaPIF3转基因青蒿的获得和分析
•     4.7.1 转基因青蒿植株的培育
•     4.7.2 转基因青蒿阳性苗的分子鉴定
•     4.7.3 转基因青蒿中目的基因AaPIF3表达量的检测
•     4.7.4 转基因青蒿中相关基因表达量检测
•     4.7.5 转基因青蒿中青蒿素与二氢青蒿酸含量检测
•   4.8 讨论
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士期间发表论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴念洋

导师: 刘小强,廖志华

关键词: 青蒿,青蒿素,转录调控

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 西南大学

分类号: Q943.2;S567.219

总页数: 79

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