基于茎环结构引物的环介导等温扩增技术检测单细胞中microRNA

论文摘要

MicroRNA（miRNA）是一类长度为19-24个核苷酸单链的非蛋白编码、内源性RNA分子,可以通过诱导靶标mRNA降解或抑制翻译的方式来调控基因表达过程。在细胞生长、分化及凋亡等多种生命过程发挥重要的调控作用。大量的研究表明,miRNA的异常表达与重大疾病,甚至肿瘤的发生密切相关,因此,miRNA被认为是一类新型的生物标志物。近年来,miRNA的检测在基础生物学研究和人类重大疾病的诊断和治疗等领域中受到了广泛的关注。但由于miRNA序列短、细胞内的丰度低且同源miRNA之间序列相似性强等特点,对miRNA分析检测提出了重大的挑战。此外,许多重大疾病尤其是癌症,往往是从极少数细胞变异开始的。而传统的miRNA分析方法是对大量细胞样本进行“群体分析”而得到的平均结果,这将掩盖不同细胞之间miRNA表达差异的重要信息。因此,单细胞中miRNA的准确定量分析对于揭示miRNA生物功能以及重大疾病的早期诊断和治疗都具有重要的意义。但是,目前现有miRNA的分析方法,或是灵敏度方面无法满足单细胞miRNA分析的要求,或是需要复杂探针设计,或是需要分离、富集等繁琐的实验步骤及昂贵的仪器。因此,亟需建立一种高灵敏度、操作步骤简单、仪器设备要求低的均相溶液中单细胞miRNA分析的方法。在本论文中,我们通过创新性地设计一对茎环结构引物并结合环介导等温扩增技术（LAMP）研究建立了一种高灵敏度、高选择性的miRNA分析方法。基于核酸指数扩增的miRNA分析方法的灵敏度主要受限于其扩增效率以及由非特异性扩增形成的背景信号。在核酸扩增的分析方法中,环介导等温扩增技术是目前扩增效率最高、灵敏度最好的恒温扩增技术之一,可以将低至几个拷贝的欲检测目标分子在恒温条件下扩增到可以检测的水平。但miRNA序列短,不能作为LAMP扩增模板。因此,我们设计了一对茎环结构的DNA引物。首先,我们根据目标miRNA特异性地设计第一个茎环结构的DNA引物,引物的3’突出的单链部分可与目标miRNA稳定杂交,随后在逆转录酶的作用下进行高效率的逆转录反应。设计针对目标miRNA特异性的第二个茎环结构DNA引物,使其在变性和退火之后沿着逆转录产物延伸形成双链DNA,通过对生成的cDNA双链进行适当的热循环扩增,这样一个目标miRNA就可以产生多个双茎环结构的DNA,该DNA结构是后续LAMP扩增反应的起始模板,可以引发低背景、高效率的LAMP扩增反应。由此建立了一种高灵敏度、高选择性的miRNA分析方法,灵敏度达到了检测单细胞中miRNA的水平,选择性达到了识别miRNA序列中单碱基差别的能力。实现了均相溶液中简便快速的单细胞中miRNA的分析。该方法可以为miRNA的基础研究和重大疾病的诊断和治疗方面提供有力的单细胞分析技术。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
•   1.1 miRNA概述
•   1.2 miRNA的分析方法研究概况
•     1.2.1 Northern印迹法
•     1.2.2 微阵列芯片技术（Microarray）
•     1.2.3 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
•     1.2.4 连接依赖的聚合酶链式反应（L-PCR）
•     1.2.5 连接酶链式反应（LCR）
•     1.2.6 滚环扩增反应（RCA）
•     1.2.7 恒温指数扩增反应（EXPAR）
•     1.2.8 原位杂交技术（ISH）
•     1.2.9 链替代扩增（SDA）
•     1.2.10 高通量测序技术
•   1.3 单细胞中miRNA分析方法
•     1.3.1 基于单微球荧光信号富集机制的单细胞中miRNA的分析
•     1.3.2 基于连接反应结合微滴式数字PCR技术单细胞中miRNA的分析
•     1.3.3 基于连接反应的聚合酶克隆技术单细胞中miRNA分析
•   1.4 环介导等温扩增技术（LAMP）
•     1.4.1 LAMP概述
•     1.4.2 LAMP在miRNA检测中的应用
•   1.5 选题目的及意义
• 第2章 基于茎环结构引物的环介导等温扩增技术检测单细胞中miRNA
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 实验试剂和仪器
•     2.2.2 实验过程
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 基于茎环结构引物的LAMP检测miRNA的原理
•     2.3.2 基于该方法检测miRNA的可行性分析
•     2.3.3 SLFP和SLRP使用浓度的优化
•     2.3.4 cDNA扩增反应中热循环数的优化
•     2.3.5 Phusion热启动DNA聚合酶用量的优化
•     2.3.6 Bst DNA聚合酶用量的优化
•     2.3.7 miRNA分析的灵敏度及线性范围
•     2.3.8 miRNA分析的特异性
•     2.3.9 miRNA分析方法的通用性
•     2.3.10 实际样品中miRNA的检测
•     2.3.11 单个细胞中miRNA的检测
• 第3章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高克俭

导师: 李正平

关键词: 茎环结构,环介导等温扩增反应,单细胞

来源: 陕西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 陕西师范大学

分类号: Q78

DOI: 10.27292/d.cnki.gsxfu.2019.000988

总页数: 67

文件大小: 5106K

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