NAP1组蛋白分子伴侣功能的结构研究

论文摘要

在真核生物中,遗传信息储存在染色质当中;染色质是由串珠样核小体构成的。在核小体中,147bp DNA缠绕在由一分子H3-H4异四聚体和两分子的H2A-H2B组成的八聚体之上。DNA的核小体封装对于遗传信息的储存很重要;但是这种封装又会使得DNA难以被读取,进而阻碍DNA复制,DNA转录以及DNA损伤修复进程。这就要求核小体处于一个组装和去组装的动态过程使得细胞既以保持基因组的完整性,又可以进行表观遗传调控。核小体的组装是一个分步进行的过程:H3-H4异四聚体首先与DNA结合,随后两分子的H2A-H2B依次沉积,完成核小体的组装。然而酸性的DNA与碱性的组蛋白的非特异相互作用会形成高聚物,因此精细的组装过程需要组蛋白分子伴侣的调控。NAP1（Nucleosome Assembly Protein 1）是一个广为人知的组蛋白分子伴侣,它在真核生物中高度保守。NAP1的盐浓度依赖的多聚化特性被广为报道,但是已解析的NAP1晶体结构全部为同二聚体,其多聚化的分子机制始终不清楚。NAP1可以在体内结合H2A-H2B（H2A.Z-H2B）和H1,在体外还可以结合H3-H4,并且被广泛用作体外的核小体组装。人们在对NAP1识别H2A-H2B的分子机制进行大量的研究,最终解析了酵母源6.7A的酿酒酵母NAP1（scNAP1）-H2A-H2B晶体结构,但是低分辨率限制了人们对其作用机理的认知;更为重要的是该晶体结构中H2A的“docking”结构域被遮挡而不能解释NAP1如何参与核小体的组装。在本论文第三章,我们通过生化实验证明秀丽线虫源NAP1核心区域（ceNAP1c）具有完整的组蛋白分子伴侣活性,并且发现单独的ceNAP1c在200mMNaCl低盐条件下主要表现为同二聚体和同四聚体的混合物。我们进一步解析了 ceNAP1c的同二聚体晶体结构,通过与scNAP1的结构比对,发现ceNAP1具有不同的凹面酸性电荷分布（形成带状酸性区域）,预示着ceNAP1具有不同于scNAP1的H2A-H2B识别模式。我们通过进一步的ceNAP1晶体堆积分析和相应的突变实验,确定了 ceNAP1的碱性β5-β6区域和“带状酸性区域”是四聚化主要界面,并提出了低盐诱导的多聚化模型。在本论文第四章,我们解析了高分辨率的ceNAP1-H2A-H2B晶体结构,通过结构分析,一分子NAP1同二聚体像手指一样“捏住”一分子H2A-H2B异二聚体。突变实验证明NAP1凹面之上的“酸性带状区域”是识别H2A-H2B的关键区域。多细胞生物中保守的“酸性带状区域”使得ceNAP1以不同于scNAP1的方式识别H2A-H2B;这种识别并不阻挡H2A的“docking”结构域,揭示了 NAP1核小体组装功能的分子机制。我们还通过ceNAP1-H2A.Z-H2B晶体结构的解析和H3-H4相关生化实验发现NAP1广泛识别组蛋白折叠模式的关键:保守的“酸性带状区域”。“酸性带状区域”既参与了 NAP1的多聚化也参与了 H2A-H2B的识别,但是二者是“兼容的”:即ceNAP1-H2A-H2B复合物在200mM NaC1条件下表现为 ceNAP1-H2A-H2B 和（ceNAP 1-H2A-H2B）2 的混合物。在第五章,我们关注了 NAP1的另外一个重要功能:体内识别H1并且参与染色质的重塑的功能。我们组装了果蝇源NAP1（droNAP1）-果蝇源H1.1（droH1.1）,ceNAP1c-ceH1.1,ceNAP1c-ceH1.X 以及 ceNAP1c-ceH1.1-H2A-H2B,确定了最简化的识别模型,为进一步的结构解析奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 NAP1背景介绍
•   1.1 引言
•   1.2 核小体
•     1.2.1 常规组蛋白
•     1.2.2 核小体结构
•     1.2.3 组蛋白变体
•   1.3 组蛋白分子伴侣
•   1.4 H2A-H2B组蛋白分子伴侣
•     1.4.1 NAP1家族
•     1.4.2 Importin蛋白质
•     1.4.3 NPM
•     1.4.4 FACT
•   1.5 NAP1家族蛋白质
•     1.5.1 NAP1
•     1.5.2 SET（SE translocation）
•     1.5.3 TSPY（Testis-specific protein）
•     1.5.4 VPS75（vacuolar protein sorting 75）
•   1.6 NAP1的细胞定位
•   1.7 NAP1家族蛋白质的多聚化
•     1.7.1 不同种属NAP1存在self-association
•     1.7.2 scNAP1的β5-β6参与多聚化
•     1.7.3 VPS75的四聚化
•   1.8 NAP1的组蛋白分子伴侣活性
•     1.8.1 NAP1识别组蛋白H2A-H2B,H3-H4
•     1.8.2 NAP1参与核小体的组装和去组装
•     1.8.3 NAP1参与组蛋白的替换
•       1.8.3.1 NAP1参与H2A.Z-H2B组蛋白替换
•       1.8.3.2 scNAP1直接替换H2A.Z
•       1.8.3.3 hNAP1参与H2A.bbd组蛋白替换
•   1.9 NAP1组蛋白分子伴侣机制探究
•     1.9.1 NAP1对于H3-H4识别机制的探究
•     1.9.2 NAP1对于H2A-H2B识别的机制的探究
•       1.9.2.1 xNAP1-H2A-H2B形成多聚环状复合物
•       1.9.2.2 scNAP1-H2A-H2B复合物结构模型
•     1.9.3 C端酸性尾巴参与结合H2A-H2B
•     1.9.4 scNAP1-H2A-H2B复合物低分辨率晶体结构
•     1.9.5 NAP1如何促进核小体组装
•   1.10 小结
• 第二章 材料与方法
•   2.1 文献调研
•   2.2 目的蛋白质边界的选择
•   2.3 目的基因片段的克隆
•   2.4 蛋白质的表达纯化
•     2.4.1 培养基的配制
•     2.4.2 蛋白质的表达
•     2.4.3 超声破碎
•     2.4.4 镍柱亲和纯化
•     2.4.5 GST亲和纯化
•     2.4.6 分子筛层析进一步纯化
•   2.5 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
•     2.5.1 小肽胶所需试剂及配方
•     2.5.2 常规胶所需试剂及配方
•     2.5.3 SDS-PAGE电泳
•   2.6 常规组蛋白的表达纯化
•     2.6.1 所需溶液配置以及所需试剂
•     2.6.2 组蛋白包涵体的获得
•     2.6.3 酸性DNA的去除
•   2.7 组蛋白的变复性
•     2.7.1 组蛋白的变性
•     2.7.2 H2A-H2B（或H3-H4）的组装
•     2.7.3 组蛋白八聚体的组装
•   2.8 核小体的组装
•     2.8.1 所需缓冲液和仪器设备
•     2.8.2 组装过程
•     2.8.3 组装结果检验
•   2.9 NAP1-组蛋白复合物组装
•     2.9.1 孵育蛋白质比例的设定
•     2.9.2 梯度透析组装
•     2.9.3 分子筛进一步纯化
•   2.10 GST-pulldown实验
•   2.11 蛋白质-核酸复合物EMSA实验
•   2.12 蛋白质的结晶与数据收取
•     2.12.1 晶体初筛及优化
•     2.12.2 晶体的脱水与数据收集
•     2.12.3 衍射数据的积分
•     2.12.4 晶体结构的解析
•   2.13 静态光散射实验
•   2.14 分析超速离心实验
• 第三章 apo-ceNAP1的结构探究
•   3.1 早期NAP1的相关实验
•     3.1.1 NAP1类蛋白质纯化方式的优化
•     3.1.2 gH2A.bbd-gH2B的纯化
•     3.1.3 hNAP1-gH2A.bbd-gH2B晶体衍射弱
•   3.2 ceNAP1的克隆和表达
•     3.2.1 NAP1种属的选择
•     3.2.2 边界的选择与基因克隆
•     3.2.3 ceNAP1的表达纯化
•     3.2.4 组蛋白的选择
•   3.3 ceNAP1c具有完整的组蛋白分子伴侣活性
•     3.3.1 ceNAP1可以与H2A-H2B（或H3-H4）形成复合物
•     3.3.2 ceNAP1c足够识别组蛋白
•     3.3.3 ceNAP1c可以与H2A-H2B（或H3-H4）形成稳定的复合物
•     3.3.4 ceNAP1c可以促进核小体的组装
•       3.3.4.1 ceNAP1c可以把组蛋白组装到DNA上
•       3.3.4.2 ceNAP1c具有组装核小体活性
•   3.4 ceNAP1在溶液中表现为dimer-tetramer动态平衡
•     3.4.1 Full length ceNAP1的多聚化受盐离子强度影响
•     3.4.2 ceNAP1c在200mM NaCl溶液中表现为多种状态的混合物
•     3.4.3 ceNAP1c表现为二聚体和四聚体的动态平衡
•   3.5 ceNAP1结构不同于scNAP1
•     3.5.1 ceNAP1c结构信息的获得
•     3.5.2 ceNAP1c同二聚体结构
•       3.5.2.1 ceNAP1c的晶体堆积
•       3.5.2.2 ceNAP1c同二聚体结构分析
•     3.5.3 ceNAP1与scNAP1的晶体结构的有显著不同
•     3.5.4 ceNAP1与scNAP1结构具有不同的酸性表面
•   3.6 ceNAP1 self-association界面探究
•     3.6.1 ceNAP1晶体结构的进一步分析
•     3.6.2 ceNAP1 acidic concave surface参与多聚化
•     3.6.3 ceNAP1碱性β5-β6参与多聚化
•   3.7 小结
•     3.7.1 ceNAP1不同的酸性区域分布
•     3.7.2 ceNAP1的self-association模型
• 第四章 ceNAP1c识别H2A-H2B的分子机制
•   4.1 ceNAP1c识别H2A-H2B核心区域
•     4.1.1 gH2A-gH2B（核心球状结构域）的制备
•     4.1.2 ceNAP1c识别gH2A-gH2B
•     4.1.3 盐浓度对识别的影响
•   4.2 ceH2A-H2B融合蛋白质
•     4.2.1 融合蛋白质设计
•     4.2.2 融合组蛋白的镍柱亲和纯化
•     4.2.3 反过镍柱去除sumo标签
•   4.3 H2A-H2B结构探究
•     4.3.1 晶体的初筛、数据收集以及解析
•     4.3.2 H2A-H2B的结构信息
•   4.4 ceNAP1c-H2A-H2B结构信息的获得
•     4.4.1 一分子NAP1 dimer识别一分子的H2A-H2B
• 2'>    4.4.2 ceNAP1c-xgH2A-gH2B与（ceNAP1c-xgH2A-gH2B）₂
•   4.5 ceNAP1识别H2A-H2B的分子机制
•     4.5.1 复合物结构细节分析
•     4.5.2 “acidic strip”决定了ceNAP1对于H2A-H2B的识别
•     4.5.3 进化上保守的“acidic strip”
•     4.5.4 复合物形成前后的构象变化
•   4.6 ceNAP1-H2A-H2B构象揭示核小体组装机制
•     4.6.1 ceNAP1与scNAP1识别H2A-H2B的方式不同
•     4.6.2 ceNAP1-ceH2A-H2B构象并不遮挡H2A的“docking domain”
•   4.7 ceNAP1如何识别H2A.Z-H2B
•     4.7.1 ceNAP1c-ceH2A.Z-H2B在溶液中表现为混合物
•     4.7.2 晶体初筛、数据收集与结构解析
•     4.7.3 ceNAP1识别H2A.Z-H2B的模式与H2A-H2B相同
•     4.7.4 不同的H2A.Z-H2B的识别模式
•   4.8 ceNAP1-H3-H4识别机制的探究
•     4.8.1 盐离子强度影响ceNAP1对H3-H4的识别
•     4.8.2 ceNAP1c-H3-H4复合物为多聚体
•     4.8.3 ceNAP1-H3-H4的晶体实验
•     4.8.4 ceNAP1用于识别H3-H4的关键位点
•   4.9 讨论
•     4.9.1 ceNAP1-H2A-H2B的结构构象揭示了NAP1参与核小体组装的分子机制
•     4.9.2 NAP1的酸性C端尾巴参与组蛋白的识别
• 2'>    4.9.3 ceNAP1c-H2A-H2B与（ceNAP1c-H2A-H2B）₂
•     4.9.4 NAP1广泛识别组蛋白的分子机理
•   4.10 展望
• 第五章 NAP1对于H1的识别
•   5.1 背景介绍
•     5.1.1 核小体-H1结构
•     5.1.2 NAP1识别组蛋白H1
•     5.1.3 NAP1可以将H1组装进入染色质
•     5.1.4 NAP1可以从染色质中“取出”H1
•     5.1.5 科学问题
•   5.2 果蝇源NAP1对droH1的识别
•   5.3 ceNAP1对ceH1.x的识别
•     5.3.1 ceNAP1c识别H1.X 38-232（H1X△N）
•     5.3.2 ceNAP1c识别H1X 116-232
•   5.4 ceNAP1c对于ceH1.1的识别
•   5.5 小结
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与参加的学术会议

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘永瑞

导师: 吴季辉,施蕴渝

关键词: 组蛋白,组蛋白分子伴侣,核小体组装

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q75

DOI: 10.27517/d.cnki.gzkju.2019.000284

总页数: 163

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