Microbacterium sp.XT11中黄原胶内切酶MiXen酶学性质的研究

论文摘要

黄原胶是由野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris产生的多功能可溶性多糖,其降解产物黄原胶寡糖能够抗氧化,抑菌,抗肿瘤,具有巨大的商业前景。目前,相对于物理法和化学法,生物酶法制备黄原胶寡糖具有条件温和,环保,产物结构可控等优点。然而,黄原胶主链的降解机理不是特别清晰,且黄原胶的三级结构是高度有序的,不易被酶法降解,致使利用酶法降解黄原胶效率低。这些阻碍了我们利用酶法降解黄原胶,制备黄原胶寡糖的工业化进程。本课题以黄原胶降解菌Microbacterium sp.XT11的黄原胶内切酶MiXen为研究对象展开讨论。首先,本工作对MiXen的序列与结构进行分析,分析结果表明,MiXen含有952个氨基酸,可能是GH9家族糖苷水解酶的一个新分支。它具有多模块结构,包括N-末端类似免疫球蛋白（lg）结构域,（α/α）6桶状催化中心和C-末端结构域。同时,对MiXen的C-末端结构域进行序列和结构的比对分析,发现它可能是一类新的碳水化合物结合模块（Carbohydrate Binding Module,CBM）。接下来,通过实验对MiXen的催化结构域和C-末端结构域的功能进行分析。首先,对MiXen进行异源表达和酶学性质表征,确定它的酶活为15.7±0.98 U/g;最适温度为40oC;最适pH为8.0;最佳缓冲液离子浓度为10 mM;相对于羧甲基纤维素（Caboxy Methyl Cellulose,CMC）,MiXen的最适底物为黄原胶;通过圆二色谱（Circular Dichroism,CD）和酶活测定,发现MiXen能有效的随机切割高度有序黄原胶主链,且在与酶温育12 h后黄原胶的无序分数由0增加至0.425±0.018;通过剪切粘度和凝胶渗透色谱分析,表明与商品化的Cellulases相比,Mi Xen能够有效的降解黄原胶。之后,通过粘度,还原糖线性分析和凝胶渗透色谱分析,证实了MiXen具有黄原胶内切酶的活性。然后,通过对不含C-末端结构域的MiXen突变体酶活的测定及C-末端结构域的表面等离子共振（Surface plasmon resonance,SPR）分析,C-末端结构域能够辅助MiXen特异性结合到高度有序的黄原胶上。最后,通过CD,原子力显微镜（Atomic Force Microscopy,AFM）,对不同修饰侧链黄原胶,即纯化黄原胶,去丙酮酸基黄原胶,去乙酰基黄原胶,去乙酰基去丙酮酸基黄原胶和去掉侧链末端甘露糖的黄原胶进行分析,发现不同修饰侧链影响黄原胶的二级结构,进而影响MiXen对黄原胶的活性。本课题所得结果为揭示一种新型黄原胶内切酶的水解机理和酶学性质提供一种新的视角,并为黄原胶寡糖的酶法制备打下基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 多糖的降解
•     1.1.1 多糖的简介
•     1.1.2 寡糖的介绍
•     1.1.3 多糖的降解方法
•       1.1.3.1 物理法降解多糖
•       1.1.3.2 化学法降解多糖
•       1.1.3.3 生物法降解多糖
•     1.1.4 常见多糖的生物降解
•       1.1.4.1 纤维素的生物降解
•       1.1.4.2 瓜尔胶的生物降解
•       1.1.4.3 壳聚糖的生物降解
•   1.2 黄原胶的生物降解
•     1.2.1 黄原胶的介绍
•     1.2.2 黄原胶寡糖的介绍
•     1.2.3 黄原胶的生物降解
•       1.2.3.1 纤维素酶降解黄原胶
•       1.2.3.2 黄原胶降解菌中的水解酶降解黄原胶
•   1.3 黄原胶内切酶的研究进展
•     1.3.1 黄原胶内切酶
•     1.3.2 黄原胶内切酶的结构特征
•     1.3.3 不同来源的黄原胶内切酶
•     1.3.4 黄原胶内切酶的底物特异性
•     1.3.5 黄原胶内切酶降解产物分析
•   1.4 本课题研究意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验菌株与质粒
•   2.2 仪器与设备
•   2.3 培养基
•   2.4 实验所需试剂
•     2.4.1 购买试剂
•     2.4.2 试剂配制
•       2.4.2.1 缓冲液
•       2.4.2.2 SDS-PAGE电泳所需试剂
•       2.4.2.3 牛血清白蛋白BSA标准曲线所需试剂
•       2.4.2.4 组氨酸标签蛋白纯化所需试剂
•       2.4.2.5 BCA法检测还原糖所需试剂
•       2.4.2.6 测定黄原胶侧链基团含量标准曲线所需试剂
•       2.4.2.7 凝胶液相色谱所需试剂
•   2.5 本文所用引物
•   2.6 常用实验方法
•     2.6.1 DNA琼脂糖凝胶电泳
•     2.6.2 PCR产物的胶回收
•     2.6.3 大肠杆菌电击转化感受态的制备及电击转化
•     2.6.4 质粒提取
•     2.6.5 大肠杆菌热击转化感受态的制备及热击转化
•     2.6.6 蛋白浓度测定
•     2.6.7 蛋白质的聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）
•     2.6.8 BCA法检测还原糖浓度
•     2.6.9 制备不同修饰的黄原胶
•       2.6.9.1 纯化黄原胶的制备
•       2.6.9.2 去乙酰基黄原胶的制备
•       2.6.9.3 去丙酮酸基黄原胶的制备
•       2.6.9.4 去乙酰基去丙酮酸基黄原胶的制备
•       2.6.9.5 黄原胶裂解酶处理过的黄原胶的制备
•     2.6.10 乙酰基含量标准曲线的绘制及乙酰基含量的测定
•     2.6.11 丙酮酸基含量标准曲线的绘制及丙酮酸含量的测定
•   2.7 黄原胶内切酶MiXen序列、结构分析
•   2.8 黄原胶内切酶MiXen及其重组体的载体构建及表达纯化
•     2.8.1 MiXen及其重组蛋白的载体构建
•     2.8.2 MiXen及其重组体的表达纯化
•       2.8.2.1 MiXen及其重组体的诱导表达
•       2.8.2.2 MiXen及其重组体的纯化
•   2.9 黄原胶内切酶MiXen的酶学性质表征
•     2.9.1 MiXen的酶活测定
•     2.9.2 温度、pH、缓冲液离子浓度对MiXen酶活影响的测定
•       2.9.2.1 温度对MiXen酶活力影响的测定
•       2.9.2.2 温度对MiXen酶活稳定性影响的测定
•       2.9.2.3 pH对 MiXen酶活力影响的测定
•       2.9.2.4 pH对 MiXen酶活稳定性影响的测定
•       2.9.2.5 缓冲液离子浓度对MiXen酶活力影响的测定
•     2.9.3 MiXen酶促动力学的测定
•     2.9.4 MiXen降解黄原胶产物性质的研究
•       2.9.4.1 MiXen降解黄原胶产物相对分子量及其分布的研究
•       2.9.4.2 MiXen降解黄原胶产物粘度的研究
•     2.9.5 MiXen切割方式的研究
•     2.9.6 MiXen C-末端结构域的验证
•     2.9.7 圆二色谱法确定黄原胶及消化产物结构的无序度
•     2.9.8 原子力显微镜观察黄原胶结构
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 MiXen的序列、结构分析
•   3.2 MiXen及其重组体MiXen-CD、MiXen-CT的载体构建及表达纯化
•     3.2.1 MiXen及其重组体的载体构建
•     3.2.2 MiXen及其重组体的诱导表达及纯化
•   3.3 MiXen的酶学性质表征
•     3.3.1 温度、pH、缓冲液离子浓度对MiXen酶活影响的测定
•     3.3.2 MiXen酶学性质研究结果
•     3.3.3 MiXen降解黄原胶产物的研究
•       3.3.3.1 MiXen降解黄原胶产物相对分子量及其分布的研究
•       3.3.3.2 不同酶降解黄原胶产物结构的比较
•       3.3.3.3 MiXen降解黄原胶产物粘度的研究
•       3.3.3.4 MiXen切割方式的研究
•     3.3.4 MiXen C-末端结构域的验证
•     3.3.5 MiXen的水解活性与黄原胶侧链修饰的关系
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙杰

导师: 杨帆

关键词: 黄原胶内切酶,黄原胶降解,黄原胶主链,水解机理

来源: 大连工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 大连工业大学

分类号: Q55

DOI: 10.26992/d.cnki.gdlqc.2019.000007

总页数: 78

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