酵母细胞壁提取物干预DON诱导猪肠上皮细胞氧化损伤及机理

论文摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）又名呕吐毒素（vomitoxin,VT）,是一种污染谷物严重且广泛存在的单端孢菌霉菌毒素,主要是镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物,对人类和动物产生复杂的毒性作用。研究表明DON诱导由ROS介导的氧化应激被认为是导致细胞死亡和凋亡的机制之一。酵母细胞壁提取物（Yeast cell wall extract,YCWE）由葡聚糖、甘露聚糖和糖蛋白组成,是一类抗氧化、抗炎、增强免疫、促生长和改善动物肠道环境的天然物质。目前,YCWE用于禽畜养殖业研究较多,但在毒素干预方面尚未有深入研究。本实验以猪肠上皮细胞（1PEC-J2）为细胞模型,探究DON对IPEC-J2细胞的毒性机制及YCWE对细胞的保护效应的机制。1.DON的细胞毒性及YCWE对其毒性干预的研究:以IPEC-J2细胞为研究对象,构建肠上皮细胞损伤模型,研究DON的毒性效应;同时探究YCWE对低浓度DON（1 μmol/L）细胞毒性的干预作用。从DON和YCWE对细胞活性、细胞形态、抗氧化及抗炎效果给予评价。结果如下:1)MTS测肠上皮细胞活性方面:DON以剂量和时间依赖性方式使细胞活性显著降低;而加入YCWE作用12-36h后DON的细胞毒性降低。2)倒置显微镜观察细胞形态方面:1 μmol/L DON作用不同时间后细胞形态被破坏,36 h后出现漂浮和贴壁不紧的细胞,而YCWE与DON共同处理细胞12、24和36 h后,YCWE明显抑制DON对1PEC-J2细胞形态的损伤,维持细胞的正常形态。3)ELISA法检测细胞培养液中炎性因子方面:1 μmol/L DON处理细胞12 h和24 h后,炎性因子IL-6、IL-8、IL-1p和TNF-α均呈现增加的趋势。与DON组相比,添加YCWE后各炎性因子的含量发生不同程度的变化。4)氧化指标方面:1 μmol/L DON处理细胞12 h和24 h后,显著增加MDA和ROS的水平,降低GSH的含量。同样激光共聚焦显微镜分析显示,DON处理细胞24 h后,细胞内ROS含量也呈现显著增加的趋势,CPDT和YCWE均能够显著抑制ROS的生成。用YCWE处理被DON损伤的IPEC-J2细胞,胞内的MDA和ROS含量下调,GSH上调。以上结果表明,1μmol/L DON显著降低细胞活性,形态被破坏,诱导氧化应激和炎症的发生;YCWE逆转了此浓度下DON的细胞毒性,并维持细胞的正常形态,具有抗炎和抗氧化的作用。2.DON诱导细胞凋亡和自噬以及YCWE干预DON细胞毒性的分子机制:由于氧化应激是细胞凋亡和自噬的重要因素,因此本研究开展了 DON作用浓度和时间对自噬的影响,建立DON诱导自噬的模型。探究DON对自噬和凋亡影响的同时,探讨YCWE对1 μmol/L DON诱导的细胞自噬和凋亡的影响。结果显示:1)DON能够激活自噬,并上调凋亡蛋白Bax的表达,但随着作用浓度及时间的增加,自噬程度减弱。YCWE与1μmol/LDON共同处理IPEC-J2细胞后,YCWE显著抑制DON诱导的细胞自噬和凋亡的发生。2)利用3-MA、Rap分别作为自噬相关通路的抑制剂和激活剂,研究自噬是否涉及DON对细胞的毒性以及YCWE是否通过调控自噬对细胞具有保护作用。①细胞活性结果表明,3-MA和YCWE均使DON损伤的细胞活力显著增加,Rap使细胞活性显著降低。②氧化指标结果显示,3-MA和YCWE均显著抑制DON诱导的MDA和ROS的上调,抑制GSH下调,Rap使ROS和MDA显著上调,GSH下调。③Western blot检测自噬和凋亡蛋白的表达水平显示,3-MA和YCWE明显逆转了 DON的自噬诱导作用且下调了由DON引起的细胞凋亡。结果表明,DON诱导细胞自噬和凋亡,且DON通过诱导细胞自噬促使细胞凋亡,YCWE则可能是通过下调DON诱导的自噬抑制凋亡的发生。3.ROS-PI3K-AKT-mTOR信号通路在低浓度DON诱导的自噬及YCWE调控自噬中的作用:由于DON诱导氧化应激和自噬,ROS负调控PI3K-AKT-mTOR信号通路,但ROS-PI3K-AKT-mTOR信号通路是否直接参与调控DON诱导的自噬及YCWE干预DON诱导的细胞损伤,并不为我们所知。因此本研究开展了以IPEC-J2为研究对象,1 μmol/LDON单独或与抗氧化通路激活剂（CPDT）、PI3K激活剂（740 Y-P）、PI3K抑制剂（LY294002）、YCWE联合处理细胞12 h,检测IPEC-J2细胞活性、自噬和PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,以证明氧化应激和PI3K-AKT-mTOR信号通路均参与DON诱导的自噬及DON诱导的氧化应激调控PI3K-AKT-mTOR信号通路,从而进一步证明DON细胞毒性及YCWE干预DON细胞毒性的分子机制。结果如下:1)细胞活性结果显示,CPDT、YCWE和740Y-P均能使细胞活性显著增加,LY294002使细胞活性显著降低。2)氧化应激参与DON诱导的自噬结果显示,CPDT使自噬相关蛋白LC3-Ⅱ蛋白明显降低,同时P62蛋白表达水平显著增加。3)PI3K-AKT-mTOR信号通路参与DON诱导的自噬结果显示,DON使P-AKT/AKT和P-mTOR/mTOR均显著降低。LY294002使LC3-Ⅱ蛋白明显上调,P62蛋白表达显著下调,同时P-AKT/AKT和P-mTOR/mTOR下调;740Y-P与LY294002结果呈现相反的趋势。4)DON诱导的氧化应激调控PI3K-AKT-mTOR信号通路结果显示,DON使P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR 均显著降低。CPDT 使 P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR均显著增加。5)ROS-PI3K-AKT-mTOR通路参与YCWE干预DON诱导的细胞自噬结果显示,DON 使 P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR 均显著降低。YCWE 使 P-AKT/AKT 和P-mTOR/mTOR均显著增加。综上结果表明,1 μmol/L DON诱导的氧化应激可能是通过调控PI3K-AKT-mTOR信号通路诱导自噬而使凋亡信号通路被激活表现出细胞毒性,而YCWE则可通过抗氧化使PI3K-AKT-mTOR信号通路激活而抑制自噬起到保护细胞的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 DON概述
•     1.1.1 DON化学性质及污染现状
•     1.1.2 DON对细胞的毒性
•     1.1.3 DON毒性分子机制
•   1.2 氧化应激
•   1.3 自噬和凋亡概述
•     1.3.1 自噬的分子过程和信号通路
•     1.3.2 细胞凋亡概述
•     1.3.3 细胞凋亡调控机制
•     1.3.4 细胞自噬和细胞凋亡
•   1.4 干预DON毒性现状
•   1.5 酵母细胞壁提取物
•   1.6 研究目的及意义
•   1.7 主要研究内容
•   1.8 研究思路图
• 第二章 酵母细胞壁提取物对DON毒性干预的作用
•   2.1 试验材料与设备
•     2.1.1 实验试剂及材料
•     2.1.2 主要仪器设备
•     2.1.3 试剂制备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 细胞培养
•     2.2.2 MTS法检测DON的细胞毒性
•     2.2.3 MTS法检测YCWE对DON细胞毒性的干预作用
•     2.2.4 ELISA法测YCWE对DON诱导的IPEC-J2细胞炎症的影响
•     2.2.5 CPDT对DON细胞活性的影响
•     2.2.6 YCWE对DON诱导的IPEC-J2细胞内氧化指标的影响
•     2.2.7 统计分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 DON的细胞毒性
•     2.3.2 YCWE对DON细胞毒性的干预作用
•     2.3.3 ELISA检测YCWE对炎性因子含量的影响
•     2.3.4 CPDT对DON细胞活性的影响
•     2.3.5 YCWE对DON诱导的IPEC-J2细胞内氧化指标的影响
•   2.4 本章小结
• 第三章 自噬在YCWE干预猪肠上皮细胞损伤中的作用
•   3.1 实验材料与设备
•     3.1.1 实验试剂及材料
•     3.1.2 主要仪器设备
•     3.1.3 试剂制备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 Western blot检测蛋白
•     3.2.2 DON诱导细胞自噬
•     3.2.3 YCWE对DON诱导的自噬和凋亡的干预作用
•     3.2.4 YCWE干预DON诱导的细胞凋亡的机理
•     3.2.5 统计分析
•   3.3 结果
•     3.3.1 DON对自噬调控蛋白表达的影响
•     3.3.2 YCWE对DON诱导的自噬和凋亡的干预作用
•     3.3.3 3-MA/Rap对IPEC-J2细胞活性的影响
•     3.3.4 YCWE抗细胞凋亡机理的研究
•   3.4 本章小结
• 第四章 ROS-PI3K-AKT-MTOR信号通路在YCWE调控自噬中的作用
•   4.1 实验材料与设备
•     4.1.1 实验试剂及材料
•     4.1.2 试剂制备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 PI3K-AKT-mTOR通路激活剂/抑制剂组对细胞活性的影响
•     4.2.2 氧化应激参与DON诱导的自噬
•     4.2.3 PI3K- AKT- mTOR通路参与DON诱导的自噬
•     4.2.4 氧化应激调控PI3K-AKT-mTOR信号通路
•     4.2.5 YCWE通过抗氧化激活PI3K-AKT-mTOR通路而抑制自噬
•     4.2.6 统计分析
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 PI3K-AKT-mTOR通路激活剂/抑制剂对细胞活性的影响
•     4.3.2 氧化应激参与DON诱导的自噬
•     4.3.3 PI3K-AKT-mTOR信号通路参与DON诱导的自噬
•     4.3.4 DON诱导的氧化应激调控PI3K -AKT- mTOR通路
•     4.3.5 YCWE通过抗氧化激活PI3K- AKT- mTOR通路而抑制自噬
•   4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 研究特色
•   5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭文燕

导师: 伍金娥

关键词: 脱氧雪腐镰刀菌烯醇,猪肠上皮细胞,细胞毒性,酵母细胞壁提取物,细胞自噬,细胞凋亡,信号通路

来源: 武汉轻工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 武汉轻工大学

分类号: TS201.3

DOI: 10.27776/d.cnki.gwhgy.2019.000228

总页数: 88

文件大小: 7492K

下载量: 102