HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因对细胞形态和生物学功能的影响

论文摘要

第一章利用CRISPR/Cas9技术在HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因目的:利用CRISPR/Cas9技术对体外培养的293T与HepG2细胞株的LMNA（Lamin A,A型核纤层蛋白）基因进行编辑,获得LMNA基因敲除细胞系,并观察细胞核膜变化以及整体细胞形态的变化。方法:利用CRISPR/Cas9系统对293T细胞以及HepG2细胞的LMNA基因进行编辑,然后进行嘌呤霉素筛选,单克隆挑取,DNA测序和western blot鉴定,对获取的LMNA双等位基因敲除细胞克隆进行扩增与保存。利用扫描电镜和透射电镜对LMNA敲除（LMNA KO）以及野生型（WT）细胞的形态与核膜形态进行观察,同时利用免疫荧光技术对LMNA敲除细胞核膜与细胞骨架进行观察。结果:DNA测序结果显示293T与HepG2单克隆细胞均有碱基缺失,蛋白免疫印迹结果显示Lamin A/C不表达,成功获得两株LMNA基因敲除细胞。光学显微镜下发现后,293T细胞的LMNA基因敲除后,与野生型比较其胞体变小变圆,突出连接减少并变细;HepG2细胞的LMNA基因敲除后,与野生型比较其细胞变成多边形,胞质较为均匀的分布在核周。透射电镜发现LMNA基因敲除后,细胞核膜失去光滑,变得凹凸不平。结论:Lamin A/C的缺失会导致体外培养细胞的核膜变形,进一步导致整个细胞形态的改变。第二章敲除LMNA基因对HepG2和293T细胞增殖、迁移、克隆形成能力与体内致瘤性的影响目的:比较293T与HepG2细胞LMNA基因敲除细胞株（LMNA KO）和野生型细胞系（WT）的细胞增殖、迁移、克隆形成能力以及体外与体内的致瘤性,研究LMNA基因缺失对细胞生物学特性的影响,并探索相关分子机制。方法:1)将293T与HepG2细胞分为WT组和LMNA KO组,利用CCK-8法检测细胞的增殖能力,利用流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期。LMNA KO细胞内过表达LMNA,Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK1与Cyclin B1,DNA损伤标志物γ-H2A.X,抑癌基因RB和P16的表达量以及组蛋白表观遗传修饰情况（H3K9me3、H3K27me3）。2)通过细胞划痕和transwell实验对WT与LMNA KO细胞的迁移与穿孔能力进行检测,并通过western blot检测MMP2,MMP9,COL1A1与integrinβ4的表达量。3)软琼脂克隆形成实验:6孔板每孔每种加入3000个细胞,4周后测量克隆体直径与数量;平板克隆形成实验:六孔板每孔加入1000细胞,2周后计数克隆体数量。4)裸鼠体内致瘤性实验:将24只4周龄雌性裸鼠随机分为4组（n=6）,分别注射293T,HepG2,293T-LMNA KO与HepG2-LMNA KO四种细胞（每只裸鼠前肢两侧腋下各注射2x106细胞量）,经过一周之后每3天测量肿瘤直径,3周后颈椎脱臼处死小鼠,剥离瘤块测量体积与重量。结果:1)293T-LMNA KO较293T-WT增殖能力下降（P<0.05）,细胞凋亡率上升（P<0.05）;293T-LMNA KO细胞出现G2/M期阻滞,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3没明显变化,CDK1下降（P<0.05）,γH2A.X表达上升（P<0.05）,P16表达上升（P<0.05）;HepG2-LMNA KO较HepG2-WT增殖能力显著下降（P<0.01）,细胞凋亡率上升（P<0.05）;HepG2-LMNA KO细胞出现G2/M期阻滞,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3表达量没显著变化,CDK1下降（P<0.05）,γH2A.X表达上升（P<0.05）,P16表达上升（P<0.05）。2)划痕实验结果显示293T-LMNA KO较293T-WT细胞水平迁移能力显著下降（P<0.001）,HepG2-LMNA KO较HepG2-WT细胞水平迁移能力显著下降（P<0.001）。transwell实验结果显示293T-LMNA KO细胞侵袭能力增强（P<0.05）,HepG2-LMNA KO侵袭能力增强,两种敲除细胞MMP2表达量升高,integrinβ4表达量升高（P<0.01）。3)软琼脂培养实验结果显示293T-LMNA KO较293T-WT克隆数量下降（P<0.05）,克隆体直径减少（P<0.05）,平板克隆实验结果显示293T-LMNA KO克隆数量减少（P<0.05）,裸鼠体内成瘤实验结果显示293T-LMNA KO瘤块体积与质量均下降（P<0.05）;软琼脂培养实验结果显示HepG2-LMNA KO较HepG2-WT克隆数量下降（P<0.05）,克隆体直径减少（P<0.05）,平板克隆实验结果显示HepG2-LMNA KO克隆数量减少（P<0.05）,裸鼠体内成瘤实验结果显示HepG2-LMNA KO瘤块体积减少（P<0.05）质量下降（P<0.01）。结论:两株LMNA KO细胞增殖能力下降,迁移能力下降,软琼脂克隆形成能力下降,且裸鼠体内成瘤能力也显著下降,但细胞侵袭能力升高;两株LMNA KO存在G2/M期阻滞,P16的表达上升,且CDK1的表达下降。

论文目录

• 个人简历
• 中英文缩写对照表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 利用CRISPR/Cas9技术在HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因
•   前言
•   实验材料与方法
•     1 实验材料
•     2 主要试剂与耗材
•     3 主要实验仪器
•     4 试剂配制
•     5 实验方法
•   实验结果
•   讨论
• 第二章 敲除LMNA基因对HepG2和293T细胞增殖、迁移、克隆形成能力与体内致瘤性的影响
•   前言
•   实验材料与方法
•     1 实验材料
•     2 主要试剂与耗材
•     3 实验仪器
•     4 实验方法
•   实验结果
•   讨论
• 参考文献
• 综述 LMNA 基因对肿瘤发生影响的研究进展
•   参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘恒

导师: 舒伟

关键词: 致瘤性

来源: 广西医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 广西医科大学

分类号: Q78

总页数: 105

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