导读:本文包含了原核及真核表达论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,曲霉,酵母,生物,因子,布鲁氏菌,绦虫。
原核及真核表达论文文献综述
李佳慧,杨芳芳,王珍,张赛南,王首锋[1]（2019）在《新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达》一文中研究指出通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F_1、R_1和F_2、R_2,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL~(-1)G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示:在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L~(-1)后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL~(-1),重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL~(-1)。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL~(-1),经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL~(-1)。(本文来源于《浙江大学学报(理学版)》期刊2019年04期）
朱琳[2]（2019）在《布鲁氏菌真核及原核表达重组Omp10-Omp28-L7/L12亚基免疫效果的比较》一文中研究指出布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体。它可以造成牲畜和人类感染,并在流行区域引起恐怖的生物威胁。目前,一些布鲁氏菌减毒活疫苗被用于家畜免疫。然而,这些疫苗对人类是致病性的,在给怀孕的牲畜注射时会引发流产,并在接种疫苗的家畜中诱导抗体,干扰诊断。因此,提高针对布鲁氏菌疫苗的免疫保护效果和安全性至关重要。目前,重组蛋白亚单位疫苗被认为是预防布鲁氏菌病的有希望的新一代安全有效的替代品。在我们的研究试验中,我们经过毕赤酵母(P.pastoris)真核系统和大肠杆菌(E.coli)原核系统表达了布鲁氏菌的重组Omp10-Omp28-L7/L12蛋白,用重组蛋白作为免疫原来评价免疫应答。此外,我们研究小组发现并以免疫调节因子泰山松花粉多糖(Taishan pinus pollen polysaccharide,TPPPS)为佐剂研究其对免疫原的免疫调节作用。我们将小鼠分成4组,分别接种Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物),Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物)+TPPPS,Omp10-Omp28-L7/L12(大肠杆菌表达产物)和磷酸盐缓冲液(PBS)。随后我们检测了抗体水平,脾淋巴细胞增殖,CD_4~+和CD_8~+T细胞的数目以及细胞因子分泌并且用攻毒保护试验来评估各疫苗的免疫效果。实验结果分析表明,接种Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白组的免疫效果显着高于PBS对照组。此外,在巴斯德毕赤酵母中表达的重组Omp10-Omp28-L7/L12亚单位疫苗表现出比在大肠杆菌中表达的更高的免疫原性。另外,TPPPS被证明是重组Omp10-Omp28-L7/L12亚单位疫苗的良好免疫增强剂。因此,重组Omp10-Omp28-L7/L12亚基与TPPPS佐剂结合,显示出作为预防布鲁氏菌病的有效布鲁氏菌疫苗的潜力。设计Omp10-Omp28-L7/L12融合基因序列并由金唯智公司进行密码子优化合成融合基因,将PCR扩增得到的融合蛋白基因与克隆质粒pMD18-T载体结合,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α菌株中以增大产量。将验证正确的pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12大肠杆菌转化体以及空白表达质粒pET-28a(+)加入IPTG培养,37℃振荡培养至6 h,并在IPTG诱导后1、3、5和6 h取菌液,4℃离心,收集菌体裂解产物。并制作了Omp10、Omp28和L7/L12的多克隆抗体以作为后续实验材料。将验证正确的pPIC9-Omp10-Omp28-L7/L12以及空白表达质粒pPIC9转入至巴斯德毕赤酵母中并由甲醇诱导蛋白质表达,在甲醇诱导完成的24、48、72和96 h通过离心收获培养物上清液。利用SDS-PAGE以及Western Blot印迹分析鉴定,经分析,在蛋白凝胶层析中出现了分子大小是55.4 kDa的目标条带,而且空白对照孔是没有出现这样的条带。试验证明了在阳性孔中出现的条带大小和我们的目标蛋白是一致的。Western Blot检测出了同样大小的条带,和SDS-PAGE中检测到的相符。将表达蛋白进行镍柱纯化,之后再用SDS-PAGE检测,此时,在检测结果中只有大小是55.4kDa的单一目标条带。把纯化的Omp10-Omp28-L7/L12蛋白与我们实验室制作的松花粉多糖以1:1比率混匀制成蛋白疫苗。将120只5-6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为4组,每组有30只,并喂养在相同的饲养条件中。I-IV组中的所有小鼠分别皮下接种纯Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物),Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物)+TPPPS,纯Omp10-Omp28-L7/L12(大肠杆菌表达产物)和PBS,并在接种后第7 d和第14 d加强免疫。在接种后的0、14、28、42和56 dpv时,在每个分组中随机选择5只小鼠采血再分别通过流式细胞技术、MTT检测方法和ELISA检测技术、以评估相关免疫指标。主要检测外周血CD_4~+与CD_8~+比例、T淋巴细胞的转化率、血清抗体水平和IL-2、IFN-γ分泌水平这些免疫指标。还用攻毒保护试验来评估各疫苗的免疫效果。检测后显示由真核毕赤酵母表达的Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白促进小鼠分泌特异性抗体水平高于由原核大肠杆菌表达的Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白,而且,也显示了佐剂松花粉多糖显着增强了小鼠免疫应答水平。研究结果为提高布鲁氏菌亚单位疫苗的免疫效力提供了新的前景。(本文来源于《山东农业大学》期刊2019-03-27）
盛佳璐,宗乾坤,喻飞,王浩,吕利群[3]（2018）在《利用原核及真核表达系统体外表达草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒外突VP56蛋白的研究》一文中研究指出草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒是当前引起我国草鱼出血病的主要流行毒株,VP56是其外层衣壳上的唯一突起蛋白并有可能在病毒入侵阶段发挥核心作用,但该蛋白的具体功能尚不清楚。为了探讨VP56的生物学功能,分别利用大肠杆菌原核表达系统和杆状病毒真核表达系统研究了VP56的体外表达特性。首先从GCRVJX02W株的细胞感染混合物中抽提总RNA,并通过RT-PCR方法获得目的基因VP56,分别克隆至pGEX-4T-3及pFastBacHTA载体上,将质粒pGEX-4T-3-VP56转化至BL21(DE3),经IPTG诱导后,成功表达融合蛋白GST-VP56,大小为83ku,以包涵体形式存在;蛋白经纯化后免疫老鼠,制备了VP56的多克隆抗体,可以和rVP56产生特异性免疫结合。将pFastBacHTA-VP56转化至DH10Bac,成功转座后,提取重组杆粒DNA并鉴定且测序正确后转染SF9昆虫细胞。结果表明,自转染96h起,转染杆粒的细胞生长停滞,不断裂解。Westernblot结果显示,细胞表达重组蛋白His-VP56,大小约为62ku,为可溶蛋白。本研究利用原核表达系统和真核表达系统体外表达了VP56蛋白,制备了抗VP56多克隆抗体,为深入研究VP56蛋白在病毒入侵时的生物学功能奠定了基础。(本文来源于《上海海洋大学学报》期刊2018年04期）
张钰[4]（2018）在《rhAm原核/真核表达系统的构建及其生物学活性研究》一文中研究指出目的:临床上牙周疾病治疗的终极目标在于恢复牙周组织原有的结构和功能—即牙周组织再生,形成牙周新附着。尽管从猪的牙胚中提取的釉基质蛋白(Enamel matrix proteins,EMPs)已经用于了被病变破坏的牙周组织的修复,实现牙周组织的功能性重建,但商品化的EMPs仍存在获取来源限制,获取方法耗时耗力等诸多问题。近年来,有研究者们提出釉原蛋白(amelogenin,Am)是EMPs促进牙周组织再生的主要活性成分,有望代替EMPs用于牙周组织再生。因此,本实验通过基因工程技术构建原核和真核表达系统,分别在E.coli WK6、毕赤酵母GS115以及HEK 293F中表达并纯化出rhAm,将hPDLFs与HS-5作为靶细胞,初步探究不同来源的rhAm对其生物学特性的影响,为rhAm后续开发应用奠定实验基础。方法:(1)利用基因克隆方法获取hAm-His基因,插入pET-22b载体,构建编码hAm-His重组蛋白的原核表达质粒pET-22b-Am-His。借助电转化技术将表达质粒导入大肠杆菌WK6中进行诱导表达,目的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western Blotting对其进行鉴定。(2)利用基因克隆方法获取hAm-His基因,插入pCMV载体/pPIC9K载体,构建编码hAm-His重组蛋白的真核表达质粒pCMV-Am-His/pPIC9K-Am-His。借助瞬时基因转染技术将重组质粒pCMV-Am-His导入HEK 293F细胞,借助电转化技术将重组质粒pPIC9K-Am-His导入毕赤酵母GS115菌株。目的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western Blotting检测对其进行鉴定。(3)用MTT检测,划痕实验,ALP检测试剂盒以及Western Blotting检测等方法比较不同来源的rhAm对hPDLFs和HS-5增殖、迁移、粘附以及细胞中ALP水平的影响和对HS-5中成骨分化标志物蛋白表达的影响。结果:(1)通过SDS-PAGE和Western Blotting检测的鉴定,在E.coli WK6及HEK293F细胞中获得了分子量约25kDa的rhAm。(2)大肠杆菌表达系统与哺乳动物细胞表达系统所表达的rhAm均能显着促进hPDLFs和HS-5的增殖、迁移、粘附和细胞内ALP水平的上调,还能促进HS-5中I型胶原、RunX2的表达,且二者的作用效果无显着性差异。结论:大肠杆菌表达系统与哺乳动物细胞表达系统所表达的rhAm都具有生物活性,且它们的生物活性相似。(本文来源于《暨南大学》期刊2018-06-30）
袁晓琴,陈仕怡,刘梦茜,李春燕,许丽惠[5]（2018）在《鸡真核生物翻译起始因子2α的原核表达与多克隆抗体的制备》一文中研究指出为了获得鸡源真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor alpha two,eIF2α)的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了eIF2α基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-eIF2α。将其转化BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功表达出分子量约51 ku的重组融合蛋白。该融合蛋白表达时的最佳诱导时间、诱导温度和IPTG浓度分别为10 h、45℃和1.5 mmoL/L。通过对该蛋白进行Ni~(2+)柱亲和层析纯化,得到了较高纯度的重组蛋白。将纯化后的eIF2α蛋白免疫新西兰黄兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶8 000,试验结果为后续eIF2α蛋白功能的研究提供了帮助。(本文来源于《江西农业大学学报》期刊2018年01期）
杨舒婷[6]（2018）在《原核生物与真核生物在基因表达方面的特征比较》一文中研究指出针对全国中学生生物学联赛所涉及的生物学知识已经较多地超出高中生物学范围的现状,运用对比法,系统地介绍了原核生物与真核生物在基因表达方面的区别,为参加生物竞赛的高中生提供一些有益的帮助。(本文来源于《中学生物教学》期刊2018年02期）
谢景毅[7]（2017）在《猪圆环病毒2型Cap蛋白基因在原核和真核系统中的表达研究》一文中研究指出猪圆环病毒2型(PCV2)是引起高致死断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内给养猪业造成了重大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是该病毒主要结构和功能蛋白,由猪圆环病毒2型基因的ORF2编码合成。本论文利用大肠杆菌,毕赤酵母和黑曲霉3种不同的表达系统对PCV2-Cap进行表达研究,为PCV2亚单位疫苗的开发提供数据支持。Ⅰ PCV2-Cap在大肠杆菌中的重组表达及优化根据GeneBank公布的PCV2全基因组序列(DQ104422.1),经过密码子优化后人工合成PCV2-Cap基因。将PCV2-Cap基因去除核定位信号后插入pET-28a(+)载体中转入大肠杆菌BL21菌株中表达,经IPTG诱导,实现了猪圆环病毒2型Cap蛋白的胞外表达。亲和层析结果表明在60%buffer B条件下洗脱可以获得较高程度的纯化。对重组的PCV2-Cap蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示重组蛋白可以与一抗Anti-PCV2 Cap蛋白发生特异性的结合。Ⅱ PCV2-Cap在毕赤酵母中的分泌表达、小试发酵及重组蛋白的动物免疫试验将密码子优化的PCV2-Cap基因插入pPICZαA表达载体中,转化毕赤酵母X-33宿主,通过PCR鉴定基因组的方法筛选获得高效表达的菌株,摇瓶发酵上清中检测到了分泌表达的PCV2-Cap蛋白。在5L发酵罐中进行高密度发酵小试,发酵液上清中PCV2-Cap蛋白的产量达到了0.53 mg/m L的水平,占总蛋白定量比例的23.5%。在仔猪模型上进行了PCV2-Cap蛋白免疫抗原的体内免疫实验,重组Cap蛋白能够在动物体内刺激特异性抗体的产生。结果表明PCV2-Cap蛋白在毕赤酵母中实现了分泌表达并具有良好的免疫原性,且核定位信号的缺失不影响PCV2-Cap蛋白的免疫性能。Ⅲ PCV2-Cap在黑曲霉中的融合表达采用融合表达的策略,将PCV2-Cap基因经密码子优化后,与gla A基因N端编码糖化酶蛋白质催化域的基因序列融合,插入到pMD18-pyr G-TglaA通用表达载体中,通过同源重组整合到黑曲霉宿主的基因组上,成功实现了PCV2-Cap蛋白在黑曲霉中的胞外分泌表达,这是首次在丝状真菌表达系统中异源表达猪圆环病毒2型Cap蛋白。(本文来源于《华南理工大学》期刊2017-04-13）
郏未未[8]（2016）在《米曲霉果糖基转移酶AoFT基因的原核和真核表达及酶学性质研究》一文中研究指出果糖基转移酶具有转糖基作用,是能够催化果糖基单元从一个蔗糖分子转移到另一个蔗糖的一类酶。叁氯蔗糖是人类开发的一种最完美的强力甜味剂,蔗糖-6-乙酸酯在叁氯蔗糖合成中非常重要。生物酶法合成蔗糖-6-乙酸酯成为近年来研究的热点,果糖基转移酶可以以蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯为底物,催化合成蔗糖-6-乙酸酯。该方法具有高效性、专一性、且副产物较少等优点,因此有极大的应用潜力。在前期试验中,我们从米曲霉ZZ-01发酵液的中筛选到一种新型的果糖基转移酶AoFT,并且发现该酶能够催化合成蔗糖-6-乙酸酯的。本研究首先将来自米曲霉中表达果糖基转移酶AoFT的基因在大肠杆菌中表达,然后对大肠杆菌表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT的酶学性质进行研究。由于大肠杆菌是胞内表达体系,产物分离纯化步骤较为复杂,我们又将米曲霉果糖基转移酶AoFT的基因在毕赤酵母中克隆表达,并对毕赤酵母表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT酶学性质进行研究,对比分析毕赤酵母与大肠杆菌不同表达系统表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT酶学性质的差异,通过分析毕赤酵母表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT糖基化位点的不同,解释酶学性质变化的原因。具体研究内容如下:(1)通过RACE-PCR的方法,从米曲霉ZZ-01中克隆到果糖基转移酶AoFT基因,并分析果糖基转移酶基因序列的特性。构建重组质粒pET22b-AoFT,将重组质粒pET22b-AoFT转化至E.coli BL21感受态细胞中构建工程菌,利用IPTG诱导,使目的蛋白表达,收集菌体并经过超声破碎、离心和镍柱亲和层析纯化等分离纯化蛋白,得到目的蛋白,然后进行酶活力的测定。(2)米曲霉果糖基转移酶AoFT的催化特性研究。包括最适反应温度、最适pH和热稳定性,以及金属离子、有机溶剂、表面活性剂、还原剂和蛋白抑制剂等对米曲霉果糖基转移酶AOFT活性的影响。(3)将重组质粒pET22b-AoFT双酶切获得AoFT基因,并与pPICZαA质粒构成pPICZaA-AoFT重组质粒,经Sac Ⅰ酶切线性化后电转入毕赤酵母X33中,得到X33工程菌,甲醇诱导表达目的蛋白,收集发酵液并经过硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析等步骤纯化获得目的蛋白,然后进行酶活力测定。(4)对比分析毕赤酵母与大肠杆菌不同表达系统表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT酶学性质的不同(温度,pH等);通过分析毕赤酵母表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT糖基化位点的不同,解释酶学性质变化的原因。实验结果表明:(1)重组基因工程菌E.coli BL21经IPTG诱导能够表达目的蛋白酶米曲霉果糖基转移酶AoFT,SDS-PAGE结果显示该目的蛋白分子量约68KDa,与预期结果相符,纯化回收率达到33.6%,比活力为 65.8 U/mg。(2)大肠杆菌表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT最适反应温度和最适反应pH分别为50℃和6.0。在温度范围30-50 ℃处理1小时可以保持80%以上活性;果糖基转移酶AoFT还具有较高的pH稳定性,在pH5.0-7.0之间处理1小时可以保持80%活性以上。此外,该酶对大多数的金属离子、表面活性剂(Tween20、Triton-Xl00)和有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、甲醛、DMF、DMSO等)具有较好的抗性。变形剂SDS和尿素对该酶活性抑制作用较强,但是该酶转糖基活性不受EDTA抑制,表明该酶不是金属酶。(3)重组基因工程菌X33经甲醇诱导表达果糖基转移酶AoFT,SDS-PAGE结果显示该目的蛋白分子量约90 KDa,纯化回收率达到70.6%,比活力为71.4 U/mg。该酶最适反应温度为45℃,在20-60℃范围内,热处理lh后该酶仍保持50%以上的活性;最适pH为5.5,且在pH4.0-7.0范围内相对酶活均在60%以上。大多数金属离子、常见表面活性剂和EDTA对酶活影响不明显,并且该酶对有机溶剂有较好的抗性。此外,还原剂DTT对酶活性有抑制作用,且浓度越大抑制作用越强;高浓度的酶抑制剂对该酶具有较强的抑制作用。(4)来自毕赤酵母表达的果糖基转移酶AoFT比来自大肠杆菌表达的果糖基转移酶AoFT酶活力高,酶学性质相似,但更接近于天然的果糖基转移酶AoFT,这是因为毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行翻译后高水平的修饰和加工,一些糖基化修饰的结果。(本文来源于《郑州轻工业学院》期刊2016-06-01）
孔娜[9]（2016）在《鸡IL-18真核表达质粒及原核表达蛋白对IBD死苗的免疫增强作用》一文中研究指出将80只14日龄SPF鸡随机分为4组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为单纯疫苗试验组,Ⅲ组为质粒试验组,Ⅳ组为蛋白试验组。通过T淋巴细胞增殖试验、ELISA抗体检测和攻毒保护试验研究其对IBD灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示,从一免后21 d起,Ⅲ组和Ⅳ组都与Ⅱ组T淋巴细胞增殖和抗体水平差异显着(P<0.05),且Ⅳ组效果最好。一免42 d后进行攻毒保护性试验,Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组保护率依次为60%、80%和75%。结果表明,鸡IL-18的真核表达质粒和原核表达蛋白都具有显着增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。(本文来源于《西南农业学报》期刊2016年02期）
周玲玲,骆学农,张少华,侯俊玲,孙铭苑[10]（2015）在《猪带绦虫缺氧诱导因子-1的原核表达和真核表达及其多克隆抗体的制备》一文中研究指出为了表达猪带绦虫的缺氧诱导因子-1(HIF-1)并制备其特异性抗体,根据本课题组对猪带绦虫全基因组测序获得的HIF-1基因序列设计了1对特异性引物,以提取的猪带绦虫的总RNA为模板,通过RTPCR获得猪带绦虫HIF-1基因。将该基因定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,获得了约为17.0ku的表达产物,与目的蛋白的大小相符。原核表达的蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,ELISA和Western-blot结果表明,制备的多克隆抗体有较高的抗体效价(1∶51 200)和抗原特异性。该基因又被定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1中进行了真核表达。结果成功构建了猪带绦虫HIF-1因子的原核表达系统和真核表达系统,并制备出其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2015年07期）
原核及真核表达论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体。它可以造成牲畜和人类感染,并在流行区域引起恐怖的生物威胁。目前,一些布鲁氏菌减毒活疫苗被用于家畜免疫。然而,这些疫苗对人类是致病性的,在给怀孕的牲畜注射时会引发流产,并在接种疫苗的家畜中诱导抗体,干扰诊断。因此,提高针对布鲁氏菌疫苗的免疫保护效果和安全性至关重要。目前,重组蛋白亚单位疫苗被认为是预防布鲁氏菌病的有希望的新一代安全有效的替代品。在我们的研究试验中,我们经过毕赤酵母(P.pastoris)真核系统和大肠杆菌(E.coli)原核系统表达了布鲁氏菌的重组Omp10-Omp28-L7/L12蛋白,用重组蛋白作为免疫原来评价免疫应答。此外,我们研究小组发现并以免疫调节因子泰山松花粉多糖(Taishan pinus pollen polysaccharide,TPPPS)为佐剂研究其对免疫原的免疫调节作用。我们将小鼠分成4组,分别接种Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物),Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物)+TPPPS,Omp10-Omp28-L7/L12(大肠杆菌表达产物)和磷酸盐缓冲液(PBS)。随后我们检测了抗体水平,脾淋巴细胞增殖,CD_4~+和CD_8~+T细胞的数目以及细胞因子分泌并且用攻毒保护试验来评估各疫苗的免疫效果。实验结果分析表明,接种Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白组的免疫效果显着高于PBS对照组。此外,在巴斯德毕赤酵母中表达的重组Omp10-Omp28-L7/L12亚单位疫苗表现出比在大肠杆菌中表达的更高的免疫原性。另外,TPPPS被证明是重组Omp10-Omp28-L7/L12亚单位疫苗的良好免疫增强剂。因此,重组Omp10-Omp28-L7/L12亚基与TPPPS佐剂结合,显示出作为预防布鲁氏菌病的有效布鲁氏菌疫苗的潜力。设计Omp10-Omp28-L7/L12融合基因序列并由金唯智公司进行密码子优化合成融合基因,将PCR扩增得到的融合蛋白基因与克隆质粒pMD18-T载体结合,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α菌株中以增大产量。将验证正确的pET-28a(+)-Omp10-Omp28-L7/L12大肠杆菌转化体以及空白表达质粒pET-28a(+)加入IPTG培养,37℃振荡培养至6 h,并在IPTG诱导后1、3、5和6 h取菌液,4℃离心,收集菌体裂解产物。并制作了Omp10、Omp28和L7/L12的多克隆抗体以作为后续实验材料。将验证正确的pPIC9-Omp10-Omp28-L7/L12以及空白表达质粒pPIC9转入至巴斯德毕赤酵母中并由甲醇诱导蛋白质表达,在甲醇诱导完成的24、48、72和96 h通过离心收获培养物上清液。利用SDS-PAGE以及Western Blot印迹分析鉴定,经分析,在蛋白凝胶层析中出现了分子大小是55.4 kDa的目标条带,而且空白对照孔是没有出现这样的条带。试验证明了在阳性孔中出现的条带大小和我们的目标蛋白是一致的。Western Blot检测出了同样大小的条带,和SDS-PAGE中检测到的相符。将表达蛋白进行镍柱纯化,之后再用SDS-PAGE检测,此时,在检测结果中只有大小是55.4kDa的单一目标条带。把纯化的Omp10-Omp28-L7/L12蛋白与我们实验室制作的松花粉多糖以1:1比率混匀制成蛋白疫苗。将120只5-6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为4组,每组有30只,并喂养在相同的饲养条件中。I-IV组中的所有小鼠分别皮下接种纯Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物),Omp10-Omp28-L7/L12(毕赤酵母表达产物)+TPPPS,纯Omp10-Omp28-L7/L12(大肠杆菌表达产物)和PBS,并在接种后第7 d和第14 d加强免疫。在接种后的0、14、28、42和56 dpv时,在每个分组中随机选择5只小鼠采血再分别通过流式细胞技术、MTT检测方法和ELISA检测技术、以评估相关免疫指标。主要检测外周血CD_4~+与CD_8~+比例、T淋巴细胞的转化率、血清抗体水平和IL-2、IFN-γ分泌水平这些免疫指标。还用攻毒保护试验来评估各疫苗的免疫效果。检测后显示由真核毕赤酵母表达的Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白促进小鼠分泌特异性抗体水平高于由原核大肠杆菌表达的Omp10-Omp28-L7/L12重组蛋白,而且,也显示了佐剂松花粉多糖显着增强了小鼠免疫应答水平。研究结果为提高布鲁氏菌亚单位疫苗的免疫效力提供了新的前景。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
原核及真核表达论文参考文献
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